Gik ma nyalo miyo ringruok obed gi teko mar geng’o tuoche gin gik madongo ma nyalo miyo ng’ato obed gi ng’ol (TME), kata kamano, ka ok oweyo moko matin, pod ok ong’ere ahinya ni gin ng’a gini. Kae, ne wanono ng’injo kod sel mag T ma wuok e ng’injo kod ng’injo mag jotuwo ma nigi kansa mar ng’injo ma malo (HGSC) mondo wafweny kaka ng’injo mag TME mopogore opogoregi nyalo lokore. Ascites kod sel mag tumor nigi pogruok maduong’ e kind gik ma ng’ato nyalo ng’ado. Ka opim gi tuoche mag ng’ut, sel mag T ma donjo e ng’ut ng’ato nigi gik mathoth ahinya ma nyalo miyo ng’ato obed gi ng’ol (MNA). Kata obedo ni kwan mar MNA e sel mag T oting’ore malo, ng’eny mar gik ma nyalo miyo ng’ato obed gi ng’ol (enzyme ma konyo e ng’ado ng’ato ng’ato) nyalo bedo mana e sel ma nigi ng’ol kod sel ma nigi ng’ol. Kaka MNA tiyo, miyo sel mag T golo gik ma kelo tuoche ma kelo tuoche ma kelo tuoche mag alfa. Omiyo, MNA ma owuok kuom TME konyo e rito teko mar del mar T kendo ochung’ ne gik ma nyalo konyo e thieth mar kansa mar dhano.
Gik ma wuok kuom tuoche nyalo bedo gi teko maduong’ ahinya e geng’o teko mar del ma geng’o tuoche, kendo gik mathoth ma yudore nyiso ni bende ginyalo bedo kaka teko maduong’ ma miyo tuoche dhi nyime (1). Kaachiel gi gik ma Warburg kelo, tich ma osetim machiegni osechako ng’eyo kaka sel mag ng’ut ng’ato nyalo ng’iyo gik moko kod tudruok ma en-go gi kaka ng’ato nyalo geng’o ng’ut ng’ato (TME). Gik ma notimre kuom ranyisi mag ng’ombe kod sel mag T mag dhano osenyiso ni ng’injo mar glutamin (2), ng’injo mar oksidatif (3) kod ng’injo mar glukosis (4) nyalo tiyo kendgi kuom grup mopogore opogore mag sel mag ringruok ma rito ringruok. Gik mathoth ma ng’ato nyalo ng’ado e ringregi e yorego geng’o tich ma sel mag T timo mar kedo gi tuoche. Ne onyiso ni geng’ruok mar gik ma nyalo ketho ringruok nyalo ketho dongruok mar seche mag T, kendo medo mar BH4 e ringruok nyalo medo dwoko mar del ma geng’o tuoche ma CD4 kod CD8 loso. Kaachiel gi mago, nyalo mar geng’o tuoche mag del nyalo reso kuom miyo ng’ato BH4 (5). E ng’at ma nigi tuwo mar glioblastoma ma nyalo lokore, ng’ato nyalo geng’o ng’ato mondo kik otim gik moko, geng’o ng’injo mar T mondo kik otim gik moko, mondo kik omed dongo, kendo mondo kik otim gik ma nyalo miyo ng’ato otim gik moko (6). Kawuono, osenyis ni metilglioksal, ma en gik ma wuok kuom ng’injo, olosi gi sel ma geng’o ng’injo ma wuok kuom myeloid, kendo ng’injo mar T nyalo geng’o tich mar sel T ma kelo ng’injo. E thieth, keto methylglyoxal e piny nyalo loyo tich mar sel ma geng’o ng’ato (MDSC) kendo nyalo medo thieth mar ng’ado ng’ato e ranyisi mag ng’ato (7). Gik ma ne otimrego duto nyiso ni gik madongo ma wuok kuom TME nigo e rito kaka T cell tiyo kod kaka gitimo.
Oganda mang’eny osebedo ka ng’eyo ni sel mag T ok tiyo maber e kansa mar ovari (8). <2Zepa> Mano timore nikech kido mag ng’injo ma nitie e ng’injo ma ok ng’injo kod ng’injo ma ok owinjore (9), ma miyo glukosis kod triptofan lokore gik ma ng’injo kaka asid mar laktik kod kynurenin. 10, 11:10, 11. 11:10, 11. 10 Laktat ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre ng’ato, dwoko piny kwan mar gik ma nyalo ketho del (IFN-γ) kendo miyo ng’ato bedo gi pogruok e kind grup matindo ma nyalo ketho del (10, 11). 12-14 Ka ng’ato otiyo gi tryptophan, mano geng’o ng’eny mar sel mag T kendo geng’o ng’injo mar sel mag T (12-14). Kata obedo ni ne oneno gik ma kamago, tich mang’eny ma ne ochung’ne kaka ringruok nyalo lokore e del mar T e vitro ka oti kod yore mabeyo, kata mana kuom ranyisi mag oyieyo ma chalre e vivo, ma onge kata achiel kuomgi ma nyiso chuth pogruok mag kansa mag dhano kod alwora maduong’ kod matin mar ringruok.
Gima pile ma ng’ato yudo kuom kansa mar ovari en landore e ich kendo nenore ni ng’ato nigi ng’ol. Ka ng’ato ochokore gi pi ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre ng’ato, mano tudruok gi tuo ma osedhi nyime kendo bedo gi ng’eyo marach (15). Kaluwore gi ripot ma yudore, kar ng’ato makendeni ok nyal yudo oksijen, en gi gik ma miyo ng’ato bedo gi ng’ol mang’eny (VEGF) kod gik ma miyo ng’ato bedo gi ng’ol (IDO), kendo odonjo e ng’ut ng’ato gi sel ma rito ng’ato kod sel ma geng’o ng’ato bedo gi ng’ol (15-18). Kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik moko e ringre ng’ato, nyalo bedo mopogore gi kaka ng’ato ng’iyo gik moko e del owuon, omiyo ok ong’ere maber kaka sel mag T loso kendo e kar ng’ut ng’ato. Bende, pogruok madongo kod bedo ma ok chalre e kind ascites kod gik ma ng’ato nyalo yudo e alwora ma ng’ato nitie nyalo geng’o donjo mar seche ma rito ringruok kod kaka gitiyo e wi ng’ato, kendo dwarore ni otim nonro mathoth.
Mondo wabed gi nyalo mar tieko pek ma kamago, ne waloso yo mar pogo sel ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik moko kendo ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo (LC-MS/MS) mondo wapuonjre kit sel mopogore opogore (ma oting’o sel mag CD4 + kod CD8 + T) kaachiel gi ei sel kod e kind sel mag del. Watiyo gi yo ma kamano kanyakla gi ng’iyo ma nigi rang’iny mamalo mar ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo (scRNA-seq) mondo omiwa picha ma ng’ato nyalo ng’eyo maber kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik moko e del. Oboke ma kamago ne nyiso ni kwan mar 1-methylniconamide (MNA) ma ne ni e sel mag T ma nigi tumor ne omedore ahinya, kendo nonro ma ne otim e vitro ne nyiso ni ne ok ong’ere chon kaka MNA nyalo konyo sel ma nigi tuo mar T. Kaka duto, yo ma kamano nyiso kaka ng’ato nyalo ng’ado bura e kind tumor kod sel ma rito ringruok, kendo omiyo ng’ato ng’eyo makende kuom gik ma rito ringruok, ma nyalo bedo gi konyruok e thieth mar kansa mar ovari ma luwore gi sel mag T.
Ne watiyo gi ranyisi ma malo mar ng’ado ng’ato mondo wapim e kinde achiel kwan mar sukari ma ng’ato kawo kod kaka mitochondria timo gik moko. ranyisi ma pile ma nyiso pogruok e kind sel ma rito ringruok kod kwan mar sel ma nigi tumor (Tebol S2 kod Ranyisi S1A). Otim nonro ma ne otimre nonyiso ni ka opim gi sel mag T, sel mag ascite kod sel mag tumor nigi nyalo maduong’ mar kawo glukosis, to gin gi pogruok matin ahinya e kaka gik moko tiyo. <2Zepa> Glukosis ma ng’ato kawo e sel mag ng’ut [CD45-EpCAM (EpCAM)+] en nyadidek nyaka ang’wen mar sel mag T, kendo ng’eny mar glukosis ma CD4 + T kawo en nyadi 1.2 mar sel mag CD8 + T, ma nyiso ni sel mag CD8 + T (TIL) nigi gik ma opogore opogore ma ng’ato nyalo ng’ado. Ka ipimo gi mano, tich ma ng’ato timo e sel mag tumor chalo gi ma CD4 + T timo, kendo tich ma ng’ato timo e sel ariyogo duto ni malo moloyo ma CD8 + T timo (Fweny 1B). Kuom duto, duoko ma kamago nyiso kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik moko e del. Gik ma ng’ato timo e ringre ng’ato moloyo mag CD4 + T, kendo gik ma ng’ato timo e del mar CD4 + T ng’eny moloyo ma CD8 + T timo. Kata obedo ni gik ma kamago kelo gik ma kamago e kind kit seche mopogore opogore, onge pogruok ma ng’ato nyalo bedogo e chal mar ng’injo mar seche mag CD4 + kod CD8 + T kata e kwan margi ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato ka opim gi ng’ato (Fweny 1C). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, e ng’et CD45, kwan mar EpCAM+ ma ni e ng’ut ng’ato ne omedore ka iporo gi ng’ut ng’ato ma nigi ng’ol (Fweny 1D). Bende, ne waneno pogruok maler ma nitie e kind gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ringregi. 10:10, 11. 10 EpCAM + (tumor) sel nigi ng’injo ma malo mar glukosis kod tich mang’eny moloyo sel mag EpCAM-, ma en sel ma malo ahinya moloyo tich mar ng’injo mar fibroblasts e sel mag tumor e TME (Fweny 1, E kod F).
(A kod B) Ng’eny mar ler ma ng’ato kawo (MFI) mar ng’ado glukosis (2-NBDG) (A) kod tich mar CD4 + T (MitoTracker makwar makwar) (B) Graf ma nyiso (e korka achich) kod data ma ondiki (e korka achich), CD8 + T kod sel mag EpCAM + CD. (C) Ratio mar CD4 + kod CD8 + (mar CD3 + T) e ng’injo kod ng’injo. (D) Kido mar EpCAM + sel mag ng’injo e ng’injo kod ng’injo (CD45-). (E kod F) graf ma nyiso (e korka achich) kod weche ma ondiki e tablo (e korka achich) Ascites kod sel mag tumor. (G) Graf ma nyiso kaka CD25, CD137, kod PD1 nyisore kuom ng’iyo gik ma ng’ato timo. (H kod I) CD25, CD137 kod PD1 nyisore e CD4 + T (H) kod CD8 + T (I). (J kod K) Gik ma ok ng’eyo, ma ng’ato nyalo paro (Tcm), ma ng’ato nyalo paro (Teff) kod ma ng’ato nyalo paro (Tem) ma luwore gi kaka CCR7 kod CD45RO nyisore. Piche ma nyiso (e korka achich) kod weche ma ondiki e tebol (e korka achich) mag CD4 + T (J) kod CD8 + T (K) e ng’ut ng’ato kod ng’ut ng’ato. P kwan ma ng’ato nyalo ng’ado ka otiyo gi t-tes ma oting’o ji ariyo (* P <0.05, ** P <0.01 kod *** P <0.001). Laini ochung’ ne jotuwo ma owinjore (n = 6). FMO, ler ma rieny ma ogol achiel; MFI, teko mar ler ma diere.
Ka ne otim nonro machielo, ne oneno ni nitie pogruok mamoko madongo e kind chal mar T cell ma ne ochung’ne gik ma ne otimre ahinya. 1, G nyaka I) kod ng’eyo ma ng’ato nyalo paro (Fweny 1, J kod K) e timbe mag ng’ut ng’ato nyalo bedo mathoth moloyo ng’at ma ng’ado bura (kwan mar CD3 + T). Kaka kamano, ng’iyo gik ma ng’ato timo kuom nyiso gik ma nyiso ni ng’ato tiyo (CD25 kod CD137) kod gik ma nyiso ni ng’ato otho [protin mar tho mar sel ma oseket 1 (PD1)], ne onyiso ni kata obedo ni kido mag ng’injo mag ogandagi opogore (Fweny S1, B nyaka E) , To onge pogruok maduong’ ma ne oneno e kind ng’injo kata ng’injo ma ne ok oneno, F nyaka I). 21:10, 11. 10 Gik ma ne otimorego ne onyisre kuom tiyo kod yore mag puonjruok mag masin mondo oket gik ma nyalo ketho ringre ng’ato (21), ma ne omedo nyiso ni nitie kwan maduong’ mar sel mag ng’ut (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) e ng’ut ng’at ma tuo (Fweny S2A ). E kind kit sel duto ma ne oyudre, kwan mar sel ma nigi ng’injo ma kamano ne nyiso ni en gi ng’injo mang’eny moloyo ma nyalo kawo glukosis kendo ma nigi tich mang’eny moloyo (Fweny S2, B nyaka G). Gik ma ne oyudrego nyiso pogruok maduong’ ma nitie e kind kit sel mang’eny ma yudore e ascites kod tumor e jotuwo ma nigi HGSC.
Gima duong’ ma nyalo bedo matek e ng’eyo kido mag TIL en dwaro mar pogo sampuli mag T cell ma nigi ler moromo, ma nigi ng’eyo maber kendo ma nigi kwan moromo kuom tuoche. 22-24:10, 11. 10 Gik ma osetimre machiegni nyiso ni yore mag keto gik moko e kindgi kod yore mag loso gik moko ma luwore gi ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo nyalo kelo lokruok e ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo (22-24). Mondo wabed gi nyalo mar loyo chandruokni, ne waloso yo maber mar loso gik moko mondo wapog kendo wapog TIL kuom kansa mar ovari mar dhano ma ne ogol oko e yor opereson kapok otimne nonro gi LC-MS / MS (neno Gik Motigo kod Yore; Ranyisi 2A). Mondo wapim kaka protokolni nyalo ketho lokruok mag gik ma ng’ato timo e ringre, ne waporo gik ma ng’ato nyalo timo e del mag T ma ne otim gi jogo ma ne chiwo remo ma nigi ngima maber bang’ ng’ado bura ma malo mar pogo bead gi sel ma ne ok opogore gi bead ma ne odong’ e wi baraf. 10:10, 11. 10 Ong’eyo ni nitie winjruok maduong’ e kind gik ariyogi (r = 0.77), kendo ni nyalo mar dwoko piny mar teknoloji mar grup mar gik ma ng’ato nyalo timo kendo (Fweny 2B). Omiyo, yore gi nyalo timo nonro makare mar gik ma nyalo lokore e sel ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik ma nyalo lokore, ma miyo bedo gi nyalo mokwongo mar ng’eyo gik ma nyalo lokore e HGSC, ma miyo ji yudo ng’eyo matut kuom gik ma nyalo lokore e del.
(A) Picha mar skema mar loso gik ma nigi ng’injo mag magnet. Kapok otimnegi nonro gi LC-MS/MS, selgo biro ng’ado ng’injo adek moluwore kata biro dong’ e wi baraf. (B) Gima ng’ato nyalo timo e wi kwan mar gik ma ng’ato nyalo ng’iewo. <2Zepa> Average mar pim adek mag kit ng’ato ka ng’ato ± SE. Laini mar rangi ma rangi ne en mar 1:1 nyiso winjruok ma ni e kindgi. Oganda ma nigi tudruok e kind klas (ICC) mag pim ma idwoko ma inyiso e lebel mar axis. NAD, nikotinamaid adenin dinukleotaid. (C) Picha mar ranyisi mar kaka tich mar ng’iyo gik ma ng’ato timo e del mar tuo. Ascites kata tiuma mag ng’ato ichoko kuom jotuwo kendo iketogi e kar ng’ich. Ne otim nonro kuom ng’injo matin mar sampul ka sampul kokalo kuom ng’injo mar ng’injo mar ng’injo, to sampul ma ne odong’ ne otimne ng’injo adek mag ng’injo mag CD4+, CD8+ kod CD45-. Ne otim nonro kuom ng’injo mag selgo ka otiyo gi LC-MS/MS. (D) Map mar liet mar kwan mar gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre. Dendrogram ochung’ ne ng’injo mar Ward mar bor mag Euclidean e kind sampol. (E) Ranyisi mar gik madongo (PCA) mag map mar gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre, ma nyiso ranyisi adek ma ng’ato ka ng’ato nyalo ng’ado, ranyisi ma wuok kuom jatuwo achiel, otudore gi laini. (F) PCA mar ranyisi mar gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’at ma tuo (ma en, ka otiyo gi ng’at ma tuo); ng’at ma ng’ado bura en ng’at ma ng’ado bura. PC1, ng’injo maduong’ mar 1; PC2, kidieny maduong' mar 2.
Bang’e, ne watiyo gi yo mar loso gik moko mondo wapim gik ma nyalo lokore e CD4 +, CD8 + kod CD45 e ng’injo mag ng’injo kod ng’injo mag jotuwo auchiel ma nigi HGSC (Fweny 2C, Fweny S3A kod Tebol S3 kod S4). Oganda ma ng’ato dwaro ng’eyo gin 2% nyaka 70% mar sampul maduong’ ma ne ochung’ne sel ma ngima, kendo kwan mar sel mopogore ahinya e kind jotuwo. Bang’ pogo ng’injo, ng’injo ma nigi ng’injo ma ng’ato dwaro (CD4+, CD8+ kata CD45-) oting’o ng’injo mokalo 85% mar sel duto ma ngima e sampulno e kwan mar ng’injo. Yor loso gik moko ma kamago miyo wanyalo nono kwan mar seche ma ng’ato nigo kuom kaka tishu mag dhano loso gik moko, ma ok nyalre timo kuom sampuli madongo. Ka watiyo gi chenro ma kamano, ne wafwenyo ni l-kynurenine kod adenosine, ma gin gik ariyo ma nigi kido maber mag geng’o tuoche mag ringruok, ne oting’ore malo e sel mag T kata sel mag tuo (Fweny S3, B kod C). Omiyo, duoko ma kamago nyiso adier kod nyalo ma teknoloji marwa mar pogo sel kod ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo nyalo yudo gik ma nyalo konyo e ringruok mag jotuwo.
Ong’iyo marwa bende nofwenyo ni nitie pogruok matek e kind kit cell e kind jotuwo kod e kindgi (Fweny 2D kod Fweny S4A). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, ka opim gi jotuwo mamoko, jotuwo 70 nonyiso kido mopogore opogore mag ng’injo (Fweny 2E kod Fweny S4B), ma nyiso ni nyalo bedo ni nitie pogruok maduong’ e kind jotuwo. En gima ber ng’eyo ni ka opim gi jotuwo mamoko (lita 1.2 nyaka 2; Tebol S1), kwan mar pi ma ne ochoki e jotuwo 70 (ml 80) ne tin ahinya. Ochung’ ne ng’iyo gik ma opogore opogore e kind jotuwo e kinde ma itimo nonro mar gik madongo (kaka ranyisi, ka itiyo gi nonro mar gik madongo ma ng’ato nyalo timo) nyiso lokruok ma luwore e kind kit sel, kendo kit sel kod/kata alwora matindo ma ng’ato nyalo ng’iyogo nyalo bedo maler kaluwore gi gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo (Fweny 2F ). Ka ne otim nonro kuom gik ma ng’ato nyalo ng’ado, ne oketo ler kuom gik ma kamago kendo ne ofwenyo pogruok maduong’ e kind kit sel kod alwora matin. En gima ber ng’eyo ni pogruok maduong’ie moloyo ma ne oneno en MNA, ma thothne opong’ gi CD45- kod CD4+ kod CD8+ ma donjo e ng’ut ng’ato (Fweny 3A). Kuom sel mag CD4 +, gik ma kamago nenore ayanga ahinya, kendo MNA ma ni e sel mag CD8 + bende nenore ni gik ma ni e alwora mulo ahinya. Kata kamano, mano ok en gima duong’, nikech gin mana jotuwo adek kuom jotuwo auchiel ema inyalo pim mondo gine ni gin gi CD8+ ma nigi tumor. Kaachiel gi MNA, e kit sel mopogore opogore ma ni e ascites kod tumor, gik mamoko ma ok ng’iyo maber e TIL bende nigi mwandu mopogore opogore (Fweny S3 kod S4). Omiyo, weche ma kamago nyiso ni nitie gik ma nyalo konyo e rito ringruok mondo otim nonro matut.
(A) Gik ma MNA oting’o e CD4 +, CD8 + kod CD45- ma wuok kuom ng’injo kod ng’injo. Plot mar boksi nyiso ng’injo ma diere (laini), ng’injo ma ni e kind gik moko ang’wen (ng’injo mar frem) kod ng’injo ma ni e kind gik moko ang’wen (ng’injo mar frem) ma romo nyadi 1.5 mar ng’injo ma ni e kind gik moko ang’wen (ng’injo mar frem). Kaka ondik e buk mar Gik ma Itiyogo kod Yore mag Jotuwo, ti gi kwan mar limma mar jatuwo mondo ing’e kwan mar P (* P <0.05 kod ** P <0.01). (B) Picha mar ranyisi mar kaka MNA loso (60). Gik ma lokore e ringruok: S-adenosil-1-metionin; SAH, S-adenosin-1-homosistein; NA, nikotin; MNA, 1-metilnikotinamaid; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamaid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamaid; NR, ribos mar nikotin; NMN, nikotinamid achiel. Enzyme (ma ralum): NNMT, nikotinamaid N-metil-terisferase; SIRT, gik ma kelo ng’ol; NAMPT, nikotinamid fosforibosil tero; AOX1, aldehaid oksides 1; NRK, nikotinamid ribosaid kinaz; NMNAT, nikotinamaid achiel mar nukleotaid adenilet; Pnp1, purin nukliosaid fosforilaz. (C) t-SNE mar scRNA-seq mar ng’injo (ng’injo) kod ng’injo (makwar; n = jotuwo 3). (D) NNMT nyiso e kwan mar seche mopogore opogore ma ne ong’ere ka oti kod scRNA-seq. (E) Nyiso mar NNMT kod AOX1 e SK-OV-3, ng’injo mar ng’ato (HEK) 293T, sel mag T kod sel mag T ma osethiedh gi MNA. Onyiso ni SK-OV-3 oting’o weche ma oting’o. Onyiso kaka ng’ato nyisore gi SEM (n = 6 jogo ma nigi ngima maber). Ct ma ng’eny moloyo 35 okawe kaka gik ma ok nyal fweny (UD). (F) Nyiso mar SLC22A1 kod SLC22A2 e SK-OV-3, HEK293T, sel mag T kod sel mag T ma ne otimnegi 8mM MNA. Onyiso ni SK-OV-3 oting’o weche ma oting’o. Onyiso kaka ng’ato nyisore gi SEM (n = 6 jogo ma nigi ngima maber). Ct ma ng’eny moloyo 35 okawe kaka gik ma ok nyal fweny (UD). (G) MNA ma ni e sel mag T ma nigi ngima maber bang’ seche 72 mag ketogi e MNA. Onyiso kaka ng’ato nyisore gi SEM (n = 4 jogo ma nigi ngima maber).
MNA iloso kuom tero grup mar methyl kowuok e SAM nyaka nikotinamide (NA) kokalo kuom nikotinamide N-methyltransferase (NNMT; Ranyisi 3B). NNMT inyiso ahinya e kansa mopogore opogore mag dhano kendo owinjore gi medo, ng’anjo kod lando (25-27). Mondo wabed gi ng’eyo maber kuom kama MNA wuokie e sel mag T e TME, ne watiyo gi scRNA-seq mondo wabed gi kido mar nyiso kaka NNMT nyisore e kit sel mopogore opogore e ng’ut jotuwo adek ma nigi HGSC (Tebol S5). 6,500 ne nyiso ni e alwora ma nigi ng’injo kod ng’injo, NNMT ne nyisore mana kuom ng’injo ma ne ipare ni nitie (Fweny 3, C kod D). En gima ber ng’eyo ni onge NNMT ma nenore maler e kind oganda moro amora ma nyiso PTPRC (CD45 +) (Fweny 3D kod Fweny S5A), ma nyiso ni MNA ma yudore e spektrum mar gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo osedonjo e sel mag T. (AOX1) loko MNA obed 1-metil-2-piridon-5-karboksamid (2-PYR) kata 1-metil-4-piridon-5-karboksamid (4-PYR); 3B) bende ochung’ne kwan mar fibroblasts ma nyiso COL1A1 (Fweny S5A), ma kanyachiel nyiso ni sel mag T onge gi nyalo mar loso gik ma pile pile mag MNA. 16:10, 16. 16 Ne oting’o weche ma ne ochung’ne ng’ato ka ng’ato ma ne oting’o ng’ato ka ng’ato kuom jotuwo ma ne nigi HGSC (Fweny S5B; n = 6) (16). Kaachiel gi mago, ng’iyo ma ne otim kuom ng’injo ma ne otim gi MNA ne nyiso ni ka opim gi ng’injo ma ne ochung’ne SK-OV-3, NNMT kata AOX1 ne ok onyisre ahinya (Fweny 3E). Gik ma ok ogenogi nyiso ni MNA nyalo wuok e ng’injo kata e ng’injo mag T ma ni machiegni.
Kata obedo ni jogo ma dwaro bedo jotelo gin kaka anyuola mar jogo ma tero kation 1 nyaka 3 (OCT1, OCT2 kod OCT3) ma ondiki gi jood jogo ma tero kation ma nyalo ng’injo (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 kod SLC22A3), jogo ma nyalo tero MNA pod ok ong’ere (28). QPCR mar mRNA ma wuok kuom sel mag T ma nigi ngima maber nonyiso ni ng’ato nigi ng’injo ma piny mar SLC22A1 to ng’injo ma ok nyal fwenyre mar SLC22A2, ma ne onyiso ni ne osendik e buge motelo (Fweny 3F) (29). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, SK-OV-3 ng’injo mar ng’injo mar ng’injo ne nyiso ni ng’injo ma malo mar ng’injo ariyogo (Fweny 3F).
Mondo otem nyalo mar T cells ma nigi nyalo mar kawo MNA ma wuok e pinje mamoko, ne oketi T cells ma nigi ngima maber ma ne omiye remo kuom seche 72 ka nitie MNA mopogore opogore. Ka onge MNA ma wuok oko, gik ma ni e sel mag MNA ok nyal fweny (Fweny 3G). Kata kamano, sel mag T ma ne otimnegi tich ma ne otimnegi MNA ma oko ne nyiso ni MNA ma ne ni e selgo ne medore kaluwore gi dose, nyaka 6 mM MNA (Fweny 3G). Oboke ma kamano nyiso ni kata obedo ni kwan mar gik ma tero gik moko ni piny kendo onge enzyme maduong’ ma nigi ting’ mar loso MNA e kind sel, TIL pod nyalo kawo MNA.
Gik ma ng’ato nyalo ng’ado e sel mag T mag jotuwo kod temo mag ng’ado MNA e vitro, medo nyalo mar ni fibroblasts ma tudruok gi kansa (CAF) nyalo golo MNA kendo sel mag tumor nyalo loso kaka TIL chalo kod kaka otiyo. Mondo ong’ere kaka MNA nyalo ketho sel mag T, ne itiyo gi sel mag T ma nigi ngima maber e vitro ka MNA nitie kata ka onge, kendo ne otim nonro kuom kaka gimedo dongo kendo kaka giloso gik ma nyalo ketho ringruok. Bang’ ndalo 7 mag medo MNA e dos ma malo moloyo, kwan mar ji ma ne omedore nyadi riyo ne odok piny e yoo ma oromo, to teko ne odong’ e dos duto (Fweny 4A). Kaachiel gi mago, thieth mar MNA ma oko ne omiyo kwan mar CD4 + kod CD8 + T ma nyiso gik ma nyalo miyo ng’ato otho (TNFα; Ranyisi 4B) omedore. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nyalo bedo gi ng’eyo matut kuom ng’ato, to ne ok odok piny ahinya e ng’ato, kendo ne onge lokruok maduong’ ma ne otimore e ng’ato (IL-2; Ranyisi 4, C kod D). Omiyo, ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi gik ma ng’ato nyalo ng’ado, ne onyiso ni TNFα ne omedore ahinya, IFN-γ ne odok piny, kendo ne onge lokruok ma ne otimore e IL-2 (Fweny 4, E nyaka G). . Ka IFN-γ odok piny, mano nyiso ni MNA nyalo bedo gi tich maduong’ e geng’o tich ma sel mag T timo e lweny gi tuoche. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo kaka MNA nyalo ketho ng’ato, ng’ato nyalo ng’ado bura kuom ng’ato ma nyalo ng’ado bura kuom ng’ato (FRα-CAR-T) ma ng’ato nyalo ng’ado burane. Ne oket sel mag CAR-T kuom seche 24 ka MNA nitie, kae to ne oketgi kanyachiel gi sel mag SK-OV-3 mag ng’ut dhano ma ne nyiso α ma rwako folate e kwan mar 10:1. <2Zepa> MNA ne omiyo tich mar nego ng’ato odok piny ahinya, ma ne chal gi ng’injo ma ne otimnegi gi adenosine (Fweny 4H).
(A) Kwan mar seche duto ma nyalo dak kod kwan mar ji ma dongo nyadi riyo (PD) ma ng’ato ka ng’ato nyalo ng’ado e odiechieng’ mar 7. Graf mar bar nyiso kwan mar + SEM mar jogo ma chiwo remo auchiel ma nigi ngima maber. Ochung’ ne data ma owuok kuom n = 3 mag temo ma ok ochung’ kar ng’ato. (B nyaka D) CD3/CD28 kod IL-2 ne otigodo e loso sel mag T e kwan mar MNA ma ne gin-go kuom ndalo 7. Kapok otimnegi nonro, ne gitiyo gi PMA/ionomycin ma nigi GolgiStop kuom seche 4. TNFα (B) nyisore e sel mag T. Ranyisi mar picha (e korka achich) kod weche ma ondiki e tebol (e korka achich) mag kaka TNFα nyisore e sel ma ngima. IFN-γ (C) kod IL-2 (D) nyisore e sel mag T. Ne ipimo kaka saitokin nyisore ka itiyo gi ranyisi mar ng’ado ng’ato. Graf mar bar nyiso kwan mar jogo ma nigi ngima maber (n = 6) + SEM. Ti kod ng’iyo mar yo achiel mar ng’iyo gik ma opogore opogore kod ng’iyo ma dwokore (* P <0.05 kod ** P <0.01) mondo ing’e kwan mar P. Ochung’ ne data ma owuok kuom n = 3 mag temo ma ok ochung’ kar ng’ato. (E nyaka G) CD3/CD28 kod IL-2 ne otigodo e loso sel mag T e kwan mar MNA ma ne gin-go kuom ndalo 7. Ne ochoko gik ma ne itiyogo kapok otiyo gi seche 4 mag ng’ado bura. Ne opim kwan mar TNFα (E), IFN-γ (F) kod IL-2 (G) ka itiyo gi ELISA. Graf mar bar nyiso kwan mar jogo ma nigi ngima maber (n = 5) + SEM. P kwan mar ng’eyo ka itiyo gi yo achiel mar ng’iyo gik ma opogore opogore kod pim ma idwoko (* P <0.05). Laini ma nigi dots nyiso giko mar ng’eyo ma ng’ato nyalo yudo. (H) Tem mar ng’ado sel. 250 μM kata MNA (10 mM) kuom seche 24, kata ne oweyo ma ok otimnegi thieth (Ctrl). Ne opim kwan mar ng’ato ka ng’ato ma ne onego sel mag SK-OV-3. P nengo ma ng’ato nyalo ng’ado ka otiyo gi temo mar Welch (* P <0.5 kod ** P <0.01).
Mondo oyud ng’eyo matut mar kaka TNFα nyisore, ne otim nonro kuom lokruok ma ne timore e mRNA mar TNFα mar sel mag T ma ne otigodo gi MNA (Fweny 5A). T cells ma nigi ngima maber ma ne omiye thieth gi MNA nonyiso ni kwan mar TNFα ma ng’ato nyalo ndiko ne omedore nyadi riyo, ma nyiso ni MNA luwore gi kaka TNFα rito ndiko. Mondo otim nonro kuom yo ma nyalo bedo ni ng’ato nyalo ng’adogo bura, ne otim nonro kuom gik ariyo ma ong’ere ma rito TNFα, ma gin gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato (NFAT) kod gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato (Sp1), kaka dwoko mar MNA ma riwre gi ng’at ma rito TNFα ( 30 ). Oganda ma nigi nyalo mar timo gik moko nigi kuonde 6 ma osefweny ma NFAT nyalo tudruokgo kod kuonde 2 ma Sp1 nyalo tudruokgo, ma pong’o e kama achiel [-55 mar ng’injo mag ng’injo (bp) kowuok e 5’cap] (30). 10:10, 11. 10 Ka ng’ato otiyo gi MNA, tudruok ma Sp1 nigo gi ng’at ma kelo TNFα ne medore nyadidek. Kuong’ruok mar NFAT bende ne omedore kendo ne ochopo machiegni gi tich maduong’ (Fweny 5B). Data gi nyiso ni MNA rito kaka TNFα nyisore kokalo kuom ndiko mar Sp1, kendo e yo matin, rito kaka NFAT nyisore.
(A) Ka opim gi sel mag T ma ne odongo maonge MNA, lokruok ma TNFα nyisore e sel mag T ma ne otimnegi MNA. Onyiso kaka SEM nyiso (n = 5 jogo ma nigi ngima maber). Ochung’ ne data ma owuok kuom n = 3 mag temo ma ok ochung’ kar ng’ato. (B) Jatend TNFα ma kelo ng’injo mag T ma ne otimnegi kata maonge MNA bang’ NFAT kod Sp1 ne oriw gi (Ctrl) kod ng’injo mar PMA/ionomycin kuom seche 4. Ne otiyo gi ng’injo mar G (IgG) kod H3 kaka gik ma nyalo geng’o ng’ato mondo kik oyud ng’injo maber. Kaka ChIP ne onyiso ni tudruok mar Sp1 kod NFAT gi ng’at ma kelo TNFα e sel ma ne otimne MNA ne omedore nyadi mang’eny ka iporo gi ma ne ochung’ne. Ochung’ ne data ma owuok kuom n = 3 mag temo ma ok ochung’ kar ng’ato. P nengo ma ng’ato nyalo ng’ado kuom pim mang’eny mag t (*** P <0.01). (C) Ka opim gi ng’injo mag HGSC, sel mag T (ma ok nyal ketho ng’ato) ne nyiso ni TNF ne omedore ahinya e ng’injo. Rangigo nyiso jotuwo mopogore opogore. 300 kendo oseketgi e yo ma ok owinjore mondo ogeng’ ng’ato ma nyalo ng’ado bura mokalo kiewo (** Padj = 0.0076). (D) Ranyisi ma oket mar MNA mar kansa mar ovari. MNA iloso e sel mag ng’ut kod sel mag ng’ut ma ni e TME kendo sel mag T kawo. MNA medo tudruok mar Sp1 gi ng’at ma kelo TNFα, ma miyo TNFα medo ndiko kendo loso gik ma kelo ng’injo. MNA bende miyo IFN-γ dok piny. Ka ng’ato ogeng’o tije mag T, mano miyo nyalo mar nego ng’ato bedo matin kendo miyo tumor dongo mapiyo.
Kaluwore gi ripot, TNFα nigi teko ma geng’o tuoche kod tuoche ma luwore gi nyime kod bang’e, kata kamano, en gi tich mong’ere ahinya e konyo dongruok kod lando kansa mar ng’ut ng’ato (31-33). Kaluwore gi ripot, kwan mar TNFα ma ni e ng’injo mag ng’injo kod ng’injo mag ng’injo e kind jotuwo ma nigi kansa mar ovari, ni malo moloyo kwan mar ng’injo ma ok rach (34-36). Kaluwore gi kaka ng’ato tiyo, TNFα nyalo rito kaka seche mag remo ma rachar tiyo, tiyo kendo medore, kendo loko kaka seche mag kansa chalo (37, 38). Kaluwore gi gik ma ne oyudrego, nonro ma ne otim kuom ng’eyo kaka gik moko nyiso ni TNF ne ochung’ motegno e sel mag T e tishu mag tumor ka iporo gi ng’injo mag ng’injo (Fweny 5C). Omedore mar TNF ne nenore mana e kwan mar T cell ma nigi ng’injo ma ok nyal ketho ng’ato (Fweny S5A). E yo machuok, wechegi siro paro ma wacho ni MNA nigi teko ariyo mag geng’o tuoche mag ringruok kod teko mar keto tumor e HGSC.
Oboke mar ler ma luwore gi ng’iyo mar ng’injo mar ng’injo osebedo yo maduong’ mar puonjore kaka TIL loso gik moko. Gik ma ne otimrego osenyiso ni ka opim gi limfosit mag remo kata sel mag T ma wuok e fuoni mag limfosit madongo, TIL mag ng’ato kod mag dhano nigi nyalo maduong’ mar kawo glukosis (4, 39) kendo giweyo tije mag remo mos e yo ma ok ng’iyore (19, 40). Kata obedo ni waseneno duoko machalre e nonro maeni, gima duong’ ma ne wanyalo timo en pimo kaka sel mag ng’ut ng’ato tiyo kod TIL ma wuok e ng’ut ng’ato ma ng’ato nyalo ng’ado. Kaluwore gi moko kuom ripot ma osetim chon, ng’injo mag ng’injo (CD45-EpCAM +) ma wuok kuom ng’injo kod ng’injo nigi nyalo mar ng’injo mang’eny moloyo ng’injo mag CD8 + kod CD4 + T, ma nyiso ni ng’injo mang’eny mar ng’injo mag ng’injo inyalo pim gi ng’injo mag T. Paro mar ng’wech mar T cell. TME. Kata kamano, tich ma ng’ato timo e sel mag tumor ng’eny moloyo ma CD8 + T timo, to tich ma ng’ato timo chalo gi ma CD4 + T timo. 41, 42) Gik ma ne oyudorego miyo ng’ato bedo gi teko kuom wach ma ne owuok ni ng’ato nyalo ng’ado bura e wi gik ma nyalo ketho ringre ng’ato. Bende, giwacho ni CD8 + T nyalo bedo gi nyalo mar bedo gi ng’ol moloyo CD4 + T, kata ni CD4 + T nyalo tiyo kod gik ma kelo carbon ma ok gin glukosis mondo orit tije mag mitokondria (43, 44). Owinjore wang’e ni ne ok waneno pogruok moro amora e ng’ado glukosis kata e tije mag mitokondria e kind CD4 + T ma kelo paro, T ma kelo paro kod T ma kelo paro ma diere e ng’ut ng’ato. Kaka kamano, chal mar pogruok mar CD8 + T e timbe onge gimoro amora ma onyalo timo gi lokruok ma timore e ng’ado glukosis, ma nyiso pogruok maduong’ e kind T ma odongo e vitro kod TIL mar dhano e vivo (22). Gik ma ne onenogo bende ne osiem kuom tiyo kod yo ma ok ochung’ne ng’ato ka ng’ato, ma ne omedo nyiso ni CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + sel ma nigi ng’injo ma malo mar glukosis kendo ma nigi tich mang’eny moloyo sel mag tumor gin mathoth to gin gi kwan mar sel ma tiyo e del. Ogandani nyalo nyiso kwan matindo ma ng’ato nyalo ng’ado ni en sel ma geng’o ng’ato kata sel ma nyalo geng’o ng’ato ma ng’ato nyalo ng’iyogo ma fwenyre e nonro mar scRNA-seq. Kata obedo ni gik moko ariyogi osebedo ka ng’ere e ng’ut dhano [45], pod gidwaro Tich machielo en mar lero kwan mar myeloid ma kamago.
Kata obedo ni yore ma tiyo kod ng’iyo mar ng’ato nyalo nyiso maler pogruok maduong’ ma nitie e kind glukosis kod ng’ado mar oksidatif e kind kit sel, pok ong’ere gik ma ng’ato nyalo ng’ado e glukosis kata gik mamoko ma kelo carbon ma ng’ato nyalo ng’ado e TME. Ka ng’ato ogolo bedo kata bedo maonge mar gik ma nyalo loko ringruok e grup matin mar TIL, mano dwaro ni oler kwan mar sel ma owuok e tishu ma ogol oko. Omiyo, yorwa mar medo ng’injo mar sel ka oriw gi ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo nyalo miyo wabed gi ng’eyo matut kuom gik ma ng’ato nyalo ng’eyo e yo mopogore opogore e sel mag T kod kwan mar sel mag tumor e loso sampuli mag jotuwo ma chalre. Kata obedo ni yo ma kamano nigi ber moloyo ng’ado sel ma tiyo gi ler, laibri moko mag gik ma nyalo ketho ringruok nyalo bedo gi pek nikech bedo gi ng’iyo ma ok ng’iyore kendo/kata ng’iyo gik ma nyalo lokore mapiyo (22). Kata kamano, yo ma ne watiyogo ne nyalo fwenyo gik ariyo ma ng’ato nyalo ng’eyo ni nyalo geng’o tuoche mag ringruok, ma gin adenosine kod kynurenine, nikech gipogore ahinya e kind kit sampuli.
Ong’iyo marwa mar ng’iyo gik ma nyalo ketho ringruok kod kit TIL miyowa ng’eyo mang’eny e wi tich ma gik ma nyalo loko ringruok timo e TME mar ovari. Mokwongo, ka watiyo gi yore mag pim mar ng’ato, ne wafwenyo ni onge pogruok e kind gik ma ng’ato timo e kind ng’ato gi ng’ato ma nigi CD4 + T. Kata kamano, nonro ma ne otim gi LC-MS/MS nofwenyo ni nitie lokruok madongo e kwan mar gik ma ng’ato nyalo ng’ado e kind ogandagi, ma nyiso ni ng’ado bura kuom ng’ado mar TIL kod tije duto mag ng’ato dwaro ng’eyo tiendgi maber. Mar ariyo, MNA e gino ma kelo pogruok maduong’ie moloyo e kind sel mag CD45 kod sel mag T e ng’ut ng’ato, to ok e ng’ut ng’ato. Omiyo, ng’ado bura kod kama tumor nitie nyalo bedo gi teko mopogore opogore kuom ng’ado mar TIL, ma nyiso ni nyalo bedo ni nitie gik ma opogore opogore e alwora moro matin. Mar adek, nyiso mar enzyme ma kelo MNA miluongo ni NNMT, ochung’ ahinya kuom CAF, ma en sel mag tuoche e yo matin, to kwan mar MNA ma nyalo fwenyre nenore e sel mag T ma wuok kuom tuoche. NNMT ma ng’ato nyalo ng’eyo ahinya e CAF mar ovari nigi teko ma ong’ere mar kelo kansa, ma achiel kuomgi en nikech kelo ng’injo mar CAF, ng’injo mar tumor kod ng’injo mar ng’injo (27). Kata obedo ni kwan mar TIL duto en mar ng’ato achiel, nyiso mar NNMT e CAF nigi tudruok machiegni gi ng’at ma nigi tuwo mar kansa (TCGA), ma tudruokne nitie gi ng’at ma nyalo bedo gi tuwo marach (27, 46, 47). Gikone, nyiso ni enzyme AOX1 ma nigi ting’ mar ketho MNA bende ochung’ne kwan mar CAF, ma nyiso ni sel mag T onge gi nyalo mar loko MNA. Gik ma oseyudoregi siro paro ni kata obedo ni dwarore ni otim tich mathoth mondo onyis adier mar gik ma oseyudore, kwan maduong’ mar MNA e sel mag T nyalo nyiso ni nitie gik matin ma nyalo geng’o tuoche mag CAF.
Kaluwore ni kwan mar jogo ma tero MNA ni piny kendo kwan mar protin madongo ma donjo e loso mar MNA ok nyal fwenyre, bedo ni MNA nitie e sel mag T en gima ok geno. NNMT kata AOX1 ne ok nyal fweny kuom ng’iyo scRNA-seq kod qPCR ma ochung’ne ng’ato ka ng’ato kuom jogo ariyo ma ok ochung’ kar ng’ato. Gik ma oseyudore nyiso ni MNA ok olosi gi sel mag T, to oting’o TME ma oriwore kode. Gik ma ne otimre e vitro nyiso ni sel mag T nyalo choko MNA ma wuok oko.
Gik ma watimo e vitro osenyiso ni MNA ma oko miyo TNFα nyisore e sel mag T kendo medo tudruok mar Sp1 gi ng’at ma kelo TNFα. Kata obedo ni TNFα nigi tije ariyo mag geng’o tuoche kod tuoche mag ng’ut, e kansa mar ng’ut ng’ato, TNFα nyalo konyo e dongruok mar kansa mar ng’ut ng’ato (31-33). 32:35:10, 11. 10 Ka ng’ato oweyo TNFα e kit ng’injo mar ng’injo kata golo ranyisi mar TNFα e ranyisi mag ng’injo, mano nyalo medo loso gik ma kelo ng’injo ma TNFα nyalo kelo kendo geng’o dongruok mar ng’injo (32, 35). Omiyo, e yo ma kamano, MNA ma owuok kuom TME nyalo tiyo kaka gik ma kelo ng’ol kokalo kuom yo ma luwore gi TNFα kokalo kuom ng’ol ma ng’ato nyalo ng’iyogo, ma miyo kansa mar ng’ut ng’ato bedo kendo landore (31). Kaluwore gi nyalo ma kamano, geng’o TNFα itimo nonro kaka yo manyalo konyo e thieth mar kansa mar ng’ut ng’ato (37, 48, 49). Bende, MNA ketho nyalo ma sel mag CAR-T nigo mar ketho sel mag ng’ut ng’ato, ma miyo ng’ato bedo gi neno momedore ni MNA nyalo geng’o ng’ato mondo kik oyud tuoche. Ka giduto gichokore, duoko ma kamago nyiso ni nitie ranyisi ma tiuma kod sel mag CAF golo MNA e TME ma ok ni e sel. Kokalo kuom (i) geng’o dongruok mar kansa mar ovari ma TNF kelo kod (ii) geng’o tich mar T cell ma MNA kelo, mano nyalo bedo gi dwoko ariyo mag tuo (Fweny 5D).
E giko, kuom tiyo kod ng’injo mar ng’injo mapiyo mar selo, ng’injo mar selo achiel kod ng’injo mar selo, nonro ni nofwenyo pogruok maduong’ ma nitie e kind selo mag ng’injo kod selo mag ascites e kind jotuwo ma nigi HGSC. Ong’iyo malong’o ma kamano nonyiso ni nitie pogruok e kaka glukosis kawo kod kaka mitokondria tiyo e kind sel mag T, kendo ne gifwenyo ni MNA en gik ma ok sel ma nyalo rito ringruok. Data gi nigi teko kuom kaka TME mulo kaka sel mag T tiyo e del mag kansa mag dhano. Kata obedo ni ng’wech ma achiel kachiel mar yudo chiemo e kind sel mag T kod sel mag kansa osebedo ka ng’ere, gik ma ng’ato nyalo ng’ado e del bende nyalo tiyo kaka gik ma ok ng’iyore mondo okony dongo mar tumor kendo nyalo bedo ni gigeng’o kaka ringruok dwoko. Olero ma medore mar tich ma gik ma rito gik moko timo nyalo yawo yore moko mag medo dwoko mar del ma geng’o tuoche.
Ne oyud ranyisi mag jotuwo kod weche ma ne ondiki e klinik kokalo kuom kar keno mar tishu mag kansa mar BC ma ne omiye oboke ma ng’ato nyalo ng’eyogo gi riwruok mar kar kano tishu mag kansa mar Kanada. Kaluwore gi chik ma ne oyiego gi Komiti mar Chike mag Nonro mar Kansa mar BC kod Yunivasiti mar British Columbia (H07-00463), gik moko duto ma ne okaw kuom jotuwo kod weche ma ne ondiki e klinik ne yudo ng’eyo ma ondik kata ne giweyo ng’eyogi e yor chik. Sampolgo iketo e bang’e ma nigi oboke ma nyiso ni ng’ato nigi ratiro mar ng’ado bura. Gik ma ng’ato timo e wigi onyisre e Tebol S1 kod S5. Mondo orit gik ma ng’ato oting’o e yamo, itiyo gi masin mar ng’ado gik moko mondo otur gik ma ng’ato oting’o e ng’ut ng’atno, kae to idhi ng’adogi e filta ma nigi maikron 100 mondo oyud gik ma ng’ato nyalo ng’ado e del achiel. Ne oket ng’injo mar ng’atno e ng’injo mar 1500 rpm kuom dakika 10 e 4°C mondo oket ng’injo e delno kendo ogol gik ma ne ni e wi ng’injono. 1640 (Sigma-Aldrich), 40% mar RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) kod 10% mar dimethyl sulfoxide. Gik ma ne orit ma ne ochung’ne sel achiel ne oketgi e yamo kendo ne otigodo e ng’eyo kaka gik moko lokore e del kod ng’eyo kaka gik moko lokore e del kaka oler piny kae.
1640: AimV ma oting’o 0.22 μm ma ofilter 50:50 ma omedore. 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) ma omed gi 10% mar remo mar dhano ma ok ti gi liet (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Sayans) 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) oting’o 20 mM Hepes (ma ng’ato nyalo ng’eyo) kod 2 mM l-glutamine (ma ng’ato nyalo ng’eyo). 10:10, 11. 10 Ne oting’o 0.22 μm ma ne oting’o ng’injo ma ne opong’ gi 3% mar AB ma ne ok otiyo gi liet (Sigma). 10:10, 11. 10 Oting’o 0.22 μm mar PBS ma osefilter kendo omedore gi 0.5% mar serum mar AB ma ok otiyo gi liet (Sigma-Aldrich).
37°C, ne oketo rangi ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre ng’ato kuom dakika 30. Bang’e, ne oketo rangi ma nyalo miyo ng’ato obed gi ngima maber e F506 e 4°C kuom dakika 15. <2Zepa> Keto selgo kendo e FC Block (eBioscience) kod buffer mar keto rangi maler (BD Biosciences), ng’adgi e buffer mar keto rangi mag flow cytometer (kaluwore gi kaka jalo ma ne olosogi nonyiso), kendo ketogi e dakika 10 e ng’ich mar ot. Oketo rangi e selgo gi set mar gik ma geng’o tuoche (Tebol S2) e bufa mar keto rangi e 4°C kuom dakika 20. 16V-14B-8R) kapok otim nonro. Ti kod SpectroFlo kod FlowJo V10 e nono weche moting'o kwan mar sel, kendo ti kod GraphPad Prism 8 e loso weche go. 2-NBDG kod MT DR ne oket kaka ng’ato nyalo ng’eyo, kae to ne otiyo gi t test mar ariyo mondo otim nonro mar kwan mar jotuwo ma ne owinjore. Ogol kwan mar ji duto ma nigi gik matimore matin moloyo 40 e nonro; ng’ado nengo mar MFI mar 1 ne nengo moro amora ma ok ber kapok otim nonro mar kwan kod neno data.
10:10, 11. 10 Mondo wamed ng’ado bura gi lwedo, ne watiyo gi ndiko ma opong’o ma ne ondiki gi yien ma geng’o ng’ato (FAUST) (21) mondo wabed gi nyalo mar keto sel e kind oganda bang’ golo sel ma osetho e FlowJo. Watiyo gi lwetwa mar rito gik ma owuok mondo wabed gi kwan ma nenore ni ok oket maber (kawo PD1+ gi sel mag PD1) kod kwan ma odong’. Sampol ka sampol nigi kwan mar sel mokalo 2%, ma en kwan mar sel 11 duto.
Ne otiyo gi yo ma ng’ato nyalo ng’eyogo ng’ato mondo pogo PBMC gi gik ma itiyogo e pogo ng’injo mag remo (Teknoloji mag STEM). CD8 + T cells ne oket oko mar PBMC ka oti kod CD8 MicroBeads (Miltenyi) kendo ne omedore e yo ma opong’o ka oti kod TransAct (Miltenyi) kuom juma ariyo kaluwore gi kaka jalo ma ne oloso gik moko nonyiso. Ne oyienegi mondo ochung’ kuom ndalo 5 e piny ma opong’o ma nigi IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), kae to ne gidwokogi kendo ka gitiyo gi TransAct. E odiechieng’ mar 7, kaluwore gi kaka jalo ma ne oloso gik moko nonyiso, ne otiyo gi gik ma ng’ato nyalo ng’ado mondo omed ng’injo mag ringruok e kindgi adek moluwore. Ne oket selgo e ng’injo mondo otimnegi nonro mar ng’injo (kaka ondik malo kanyo), kendo ne oketi sel milion achiel mondo otimnegi nonro mar LC-MS/MS. Ne otim gik ma ne otimre gi LC-MS/MS kaka ondik piny kae. Ne wapimo kwan mar gik ma nyalo ketho ringruok ma ne odong’ gi namba mar ion ma romo 1,000. Sampol ka sampol iloso gi namba mar ion duto (TIC), ma iloko e yor logaritm kendo iloso kaka pile e yor ng’iyo gik moko kapok otim nonro.
Ne oting’o cell achiel mar ng’ato ka ng’ato ma ne odhi e tuwo kendo ne ogolgi kokalo kuom filta ma borne romo 40 μm mondo obed e piny ma opong’o (kaka ondik malo kanyo). Kaluwore gi kaka ng’at ma ne oloso gik moko noketo, ne otiyo gi ng’injo adek moluwore mag yiero maber kuom keto gik moko ma nyalo ketho gik moko ka itiyo gi gik matin (Miltenyi) mondo omed ng’injo mag CD8+, CD4+, kod CD45- (e wi baraf). E yo machiek, selgo iketo kendo e buffer ma miyo sel bedo motegno (kaka ondik malo kanyo) kendo ikwan. Ne iketo selgo e ng’injo mar CD8 mar dhano, CD4 mar dhano kata CD45 mar dhano (Miltenyi) e 4°C kuom dakika 15, kae to ne ilose gi ng’injo mar ng’injo mar CD4 mar dhano. Sampolno ikalo kokalo kuom ng’injo mar LS (Miltenyi), kendo ichoko ng’injo ma nigi ng’injo maber kod ma ok ber. Mondo oket kinde ma ng’ato kawo kendo omed ng’ado ng’wech mar dwoko piny, bang’e itiyo gi CD8 e ng’injo mar ariyo mar CD4+, to itiyo gi CD4 e ng’injo mar CD45 ma luwo bang’e. Ket gino ma itiyogo e loso gik moko e wi baraf e kinde duto ma ibiro pogogi.
Mondo oik sampuli mondo otim nonro kuom gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo, ne oloso selgo dichiel gi pi ma ng’ich kaka baraf, kendo ne omedo ml 1 mar methanol ma ng’ich ma ng’ich kaka baraf, kae to ne oketo ng’ich kendo ne oketo ng’ich e nitrogen ma ng’ich. Ne oket sampolgo e ng’wech adek mag ng’ich kendo ng’ich kendo ne oketgi e ng’wech mar 14,000 rpm kuom dakika 15 e 4°C. Gima ng’ato nyalo ng’ado e wi pi ma nigi gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre ng’ato, ng’ato nyalo ng’ado nyaka obed mayom. Gik ma ne olosogo ne oket kendo e 50 μl mar asid mar formik ma 0.03%, ne oketgi e vort mondo oriwre, kae to ne oketgi e kar ng’injo mondo ogol gik ma ne odong’.
Ogolo gik ma nyalo ketho ringruok kaka ondik malo kanyo. Loki pi ma oting’o pi e chumbi mar pi ma nigi teko mamalo mondo otim nonro kuom gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo. Ti kod yo mar thieth ma ok opang maber mondo ithiedh sampol ka sampol gi namba maromre mar sel mondo ogeng’ gik ma nyalo timore e kindgi. Ne watimo nonro mar ng’eyo kaka gik ma ng’ato nyalo ng’ado e piny mangima ma ne ogol chon e masin mar ng’iyo gik ma ng’ato nyalo timo e piny mangima. Ne otim nonro mar ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo kod ng’iyo gik ma ng’ato nyalo timo ka otiyo gi program mar MultiQuant (SCIEX).
1000 ne otigodo e kwan mar ion ma ne otho, kendo TIC mar sampul ka sampul ne otigodo e kwano ng’eny mar gik ma ne oyudre ma ne odong’ kaka pile mondo olos lokruok ma ne okelo gi ng’iyo mar gige tich ma ne owuok kuom loso sampul. Bang’ ka TIC osebedo kaka pile, ng’at ma ng’iyo gik moko kaka pile itiyogo (51) (paramita ma pile pile) itiyogo e loko logaritm kod ng’ado kwan mar laini mapile ma otomatik. Ne watiyo gi PCA gi paket mar R mar vegan mondo watim nonro mar ng’iyo pogruok ma nitie e kind kit sampuli, kendo ne watiyo gi nonro mar ng’iyo gik ma ng’ato nyalo timo mondo wapim jotuwo. Ti kod yo mar Ward mar loso map mar liet mondo iket bor mar Euclidean e kind sampuli. Ne watiyo gi limma (52) kuom kwan mar gik ma nyalo lokore mondo wang’e kwan mar gik ma nyalo lokore mopogore opogore e kind kit sel duto kod alwora matin. Mondo wabed gi ng’eyo mayot, watiyo gi paramita mar grup mar ng’ato ka ng’ato mondo wabed gi ranyisi, kendo waparo kit sel ma ni e alwora matin kaka grup ka grup (n = grup 6); kuom temo mar ng’eyo ng’eyo ma ng’ato nigo, ne watimo pim adek ma ne odwokore kuom gimoro ka gimoro ma ne oting’o ng’ato ka ng’ato Mondo kik obed gi dwoko ma miriambo, ne oketi ng’at ma tuo kaka gik ma ne nyalo geng’o loso limma. Mondo wane pogruok ma nitie e kind gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre jotuwo mopogore opogore, ne waloko ranyisi mar limma ma oriwo jotuwo e yo ma ok ng’iyo. <2Zepa> 10:10, 11.
Bang’ loso teko ka itiyo gi Kit mar golo sel motho mar Miltenyi (>80% mar nyalo mar dak), ne otim ranyisi mar sel achiel kuom sampuli duto mag ascites kod tumor ma ne otho ka itiyo gi protokol mar nyiso 10x 5′. Ne otim nonro kuom kes abich ma ne nigi tiuma machalre kod ascites, kata obedo ni nyalo matin mar dak kuom sampul achiel mar tiuma ne ogeng’o mondo oketgi e kwanno. Mondo wabed gi yiero mang’eny mag jotuwo, ne wachoko sampuli mag jotuwo ka jotuwo e laini mag ng’at ma rito chromium 10x, kendo ne wanono kuonde ma ne nitie ng’injo kod kuonde ma ne nigi ng’injo mopogore opogore. Bang’ ng’ado bura [28×98 bp giko mar ariyo (PE), genom mar Quebec; (53) (ma ochung’ne CellSNP kaka SNP ma pile ka pile mar dhano (VCF) ma GRCh38 chiwo ochiw kido mar ng’at ma chiwo. (IBS), ka ok oting’o sel ma ok oket kod sel ma ong’ere kaka duplex kod jochiw ma chalre e kind sampul mag ng’injo kod ng’injo (54), ne warito kes adek ma nigi ng’injo mang’eny e ng’injo kod ng’injo mondo otim nonro ma piny (Sc5o) 6975 (sel 2792 kod 4183 sel ma wuok e tumor kod ascites, kaka giluwore) mondo otim nonro. kendo ma ne oneno gi t-SNE, sel mag T ma nigi tuoche mag ringruok nyisore gi CD8A kod GZMA, ma ok oting’o gik ma nigi ng’injo matin mag ribosome.
PBMC ne opogore gi gik ma itiyogo e pogo remo (teknoloji mag STEM) kokalo kuom ng’ado ng’injo mar Ficoll. CD3 + ne opogore gi PBMC ka itiyo gi CD3 (Miltenyi). Ka MNA nitie kata ka onge, CD3+ ne itiyogo gi CD3 (5 μg/ml), CD28 ma nyalo ng’injo (3 μg/ml) kod IL-2 (300 U/ml; Proleukin). E odiechieng’ mogik mar ng’ado bura, ne otim nonro kuom nyalo mar dak (ma nyalo dak maber) kod nyalo mar dongruok (eBeads ma kwan 123, Thermo Fisher Scientific) ka itiyo gi ranyisi mar flow cytometry. ng/ml kod ionomycin (1 μg/ml) gi GolgiStop kuom seche 4, kendo luwo CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) (MAb11, bd). <2Zepa> 20 ng/ml kod ionomycin (1 μg/ml) kuom seche 4. ng/ml kod ionomycin (1 μg/ml) kuom seche 4.
Luri kod chenro mar jalos gikmoko mondo ipog RNA ka itiyo gi gino matin mar RNeasy (QIAGEN). Ti kod gino ma ng’ado gik moko (QIAGEN) mondo ilos sampol obed kaka gimoro achiel. Ti kod kit mar RNA nyaka cDNA manigi nyalo maduong' mar loso DNA ma konyo (cDNA). Ti kod TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) mondo ipim kwan mar gik ma ng’ato nyiso (kaluwore gi chenro mar jalony) ka itiyo gi gik maluwogi: 1010726_m1 (SLC22A2). Sampolgo ne otimre e sistem mar PCR ma tiyo e kinde ma adier mar StepOnePlus (Sistem mag ngima) e plate mar dwoko mapiyo mar 96-well (Gik ma tiyo) ma nigi filim mar wang’ mar MicroAmp. Nengo moro amora mar Ct ma okadho 35, okawe ni en malo mar ng’eyo kendo ondiki ni ok nyal fweny.
Timo ChIP kaka ne oler motelo (58). E yo machuok, ne itiyo gi yath ma ng’ato nyalo ng’ado (ma ng’ato nyalo ng’adoe 1.42%) kendo ne iketogi e yath ma ng’ich kuom dakika 10. 10:10, 11. 10 Ti kod gik ma geng’o ng’injo (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl kod 0.1% NP-40) e wi baraf kuom dakika 10, kae to ikete kendo e gik ma geng’o ng’injo kaka ondik (58). Bang’e, ne otim sonik mar sampulno gi gik ma luwogi: gik ma luwogi: gik ma 10 (20 ma ng’ato nyalo ng’iyogo sekon achiel) kod kinde ma ne ok ng’iyore mar sekon 40. 1μl), histone H3 (Teknoloji mar keto ranyisi mag sel; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) kod SP1 (Teknoloji mar keto ranyisi mag sel; 3μl) gi gik ma geng’o tuoche ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato. 4°C ka itiyo gi ng’injo mag chelex (Bio-Rad) mondo omed DNA, kendo iti gi ng’injo mag K (Thermo Fisher) mondo omed ng’injo mag protin. Jatelo mar TNFα ne oyudre kokalo kuom PCR: nyime, ng’at ma dhi nyime; to moloyo, ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nyalo ng’eyo ni en ng’at ma nigi bp 207 (gimoro ma nigi bp 207). Piche go ne olos gi Image Lab (Bio-Rad) kendo ne opim kwan ka gitiyo gi program mar ImageJ.
Ne ochoko gik ma ne odong’ e wi culture mar cell kaka ondik malo kanyo. Ne otim ng’ado burano kaluwore gi yore ma ne otiyogo gi gik ma ne itiyogo e ng’iyo ng’ato, gik ma ne itiyogo e ng’iyo ng’ato, kod gik ma ne itiyogo e ng’iyo ng’ato. Kaluwore gi kaka ng’at ma ne oloso gik moko noketo, ne iketo pi ma ne ni e wi pi ma ne ni e iye e 1:100 mondo ong’e TNFα kod IL-2, to 1:3 mondo ong’e IFN-γ. Ti kod masin mar somo gik mathoth (perkinelmer) mondo ipim nyalo mar ng’ado gik moko e 450 nm.
PBMC ne opogore gi gik ma itiyogo e pogo remo (teknoloji mag STEM) kokalo kuom ng’ado ng’injo mar Ficoll. CD3 + ne opogore gi PBMC ka itiyo gi CD3 (Miltenyi). Ka MNA nitie kata ka onge, CD3+ ne itiyogo gi CD3 (5 μg/ml), CD28 ma nyalo ng’injo (3 μg/ml) kod IL-2 (300 U/ml; Proleukin) kuom ndalo 3. Bang’ ndalo 3, ne ochoko selgo kendo olose gi pi ma nigi pi mang’ich ma nigi 0.9%, kendo ne oketo pelletno e ng’ich. 16V-14B-8R loso) ka itiyo gi eBeads ma kwano 123.
Ogolo gik ma nyalo ketho ringruok kaka ondik malo kanyo. Ne oting’o gik ma ne otho ma ne oting’o kendo e kwan mar 4000 ma rom gi sel/μl. 1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) kod ng’injo mar CORTECS T3 (2.1×150 mm, duong’ mar gik matin 1.6-μm, duong’ mar pore 120-Å; #18600850, #18600850, 6470, Agilent), ma ayonization mar stima tiyo e yoo maber. Okang’ mar A ma wuotho ​​en 0.1% mar asid mar formik (e H2O), okang’ mar B ma wuotho ​​en 90% mar asetonitril, 0.1% mar asid mar formik. 100% A, dakika 2 nyaka 7.1 kuom 99% B, kod dakika 7.1 nyaka 8 kuom 99% B. Kae, dwoko kendo ng’injo mar ng’injo ma nigi ng’injo ma wuotho ​​A e ng’injo mar 0.6 ml/dakika kuom dakika 3. . Okang’ ma ng’ato nyalo ng’adogo ng’ato en 0.4ml/dakika, kendo ng’ato nyalo ng’ado ng’ato gi ng’ato nyaka 50°C. Ti kod rang’iny mar kemikol maler mar MNA (M320995, Kambi mar Kemikol mar Nonro mar Toronto, York ma Nyanduat, Ontario, Kanada) mondo iket kinde mar rito (RT) kod loko (RT = dakika 0.882, loko 1 = 137→94.1, loko 2 = 137→1293). Ka lokruok adek go duto timore e kinde ma kare mar rito, lokruok 1 itiyogo e ng’ado kwan mondo ine ni en gima ng’ato nyalo ng’eyo. 1.1, 1.0, 10 kod 100 ng/ml kod 1.0 kod 10 μg/ml mar pi. ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nigi ng’ol, kendo dwoko ma ng’ato yudo en ng’at ma nigi nyalo mar ng’eyo ng’ato. Injekson ka injekson mar mikrolita ariyo mag sampul kod rang’iny itiyogo e ng’iyo LC/MS, kendo sampul mar ng’iyo ber mar ng’ato ka ng’ato itiyogo bang’ injekson aboro ka aboro mondo ine ni ng’iyono ochung’ motegno. MNA dwoko mag sampuli duto mag sel ma ne otimne MNA ne ni e kind rang’iny mar linear mar tes. Ne otim nonro mar weche ma ne ondiki ka oti kod program mar nonro mar kwan mar gik ma ne otimore (v9.0, Agilent).
αFR-CAR mar anyuola mar ariyo ne okaw kuom wende kod jowetene. (59). E yo machiek, gedono nigi gik maluwogi: CD8a ma luwore gi jatelo, ng’injo mar αFR mar dhano ma nigi ng’injo achiel ma nyalo lokore, CD8a ma ng’injo kod ng’injo ma ng’injo, CD27 ma ni e iye kod CD3z ma ni e iye. CAR ma opong’o ne olosi gi GenScript, kae to ne otim klon e vektor mar ariyo ma nyiso gik ma kelo tuoche ma ni e wi kaset mar GFP ma ne itiyogo e ng’iyo kaka gik moko nyalo lokore.
Lentivirus olosi kuom keto sel mag HEK293T [Kokruok mar Kido mar Kido mar Amerka (ATCC); 10% mar remo mar nyathi ma pod ni e ich (FBS) kod 1% mar PenStrep, kendo ne otiyo gi vector mar CAR-GFP kod plasmid mag keto gik moko e paket (psPAX2 kod pMD2. Ne ochoko gik ma ne nigi virus bang’ seche 48 kod 72 bang’ ka oseketgi e del, ne gifiltergi, kendo ne giketogi e iye ka gitiyo gi yo ma ne itiyogo e ng’adogi. <2Zepa> Ket pi ma nigi virus ma oting’o ng’injo e -80°C nyaka chop kama ng’injono ng’injoe.
PBMC ipogo gi gik ma itiyogo e pogo remo ma nigi ngima maber (teknoloji mag stemcell) kokalo kuom yo ma itiyogo gi Ficoll. Ti kod CD8 ma nyalo yiero maber (Miltenyi) mondo ipog CD8+ kuom PBMC. <2Zepa> 10:10, 11. 10 Omiyo, ng’ato nyalo ng’ado bura ne ng’ato ka ng’ato ka otiyo gi yo ma ng’ato nyalo ng’eyogo. 300 U/ml mar remo mar dhano ma ok otiyo gi liet, 1% mar remo mar dhano ma ok otiyo gi liet. Bang’ seche 24 bang’ ka osetimne gik moko, ne itiyo gi sel mag T gi lentivirus (10 μl mar virus ma oting’o ng’injo e sel 106). 1 nyaka 3 bang’ ng’ado bura e wi Cytek Aurora (e wi FSC (Ka ng’ato ng’ado e bath ng’ato), ng’i ane kaka GFP nyisore e sel mondo onyis ni ng’ato nyalo ng’ado bura ma nyalo romo 30%.
Ne oket ng’injo mag CAR-T kuom seche 24 e kar ng’injo ma ne oting’o 1% mar PenStrep e bwo gik ma luwogi: ne ok otimnegi thieth, ne otimnegi thieth gi 250 μM mar adenosine kata 10 mM MNA. Bang’ timonegi thieth motelo, ne giloso sel mag CAR-T gi PBS kendo ne giketogi kanyachiel gi sel mag SK-OV-3 20,000 [ATCC; 10: Ratio mar 1 ma ne oting’o ng’at ma ne ochung’ne 1 ne omedore e kwan mar ng’ato ma ne oting’o 10% mar FBS ma ne omedore gi 10%. Ne otiyo gi SK-OV-3 kod SK-OV-3 ma ne oting’o lysis gi digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) kaka gik ma ne ok ber kod ma ne ok ber, kaka giluwore. Bang’ seche 24 mag ng’ado puoth kanyachiel, ne ochoko pi ma ne odong’ e wi ng’ato kendo ne opim ng’injo mar ng’injo (LDH) kaluwore gi kaka jalo ma ne oloso ng’injono nonyisogi. Ne oket gik ma ne ni e wi LDH e 1:50 e bafa mar LDH. Ne ipimo kwan mar jogo ma ne onego ka itiyo gi fomula ma luwogi: kwan mar jogo ma ne onego = kwan mar jogo ma ne oloso / kwan mar jogo ma ne onego x 100%, kama kwan mar jogo ma ne onego = kwan mar jogo ma ne onego gi ng’ato achiel kende, kendo kwan mar jogo ma ne onego = kwan mar jogo ma ne onego = ng’ado bura maber-ng’ado bura marach.
Kaka oler e ndiko kata gik ma itiyogo kod yore mag timo nonro, ti gi GraphPad Prism 8, Microsoft Excel kata R v3.6.0 mar timo nonro mar kwan. Kapo ni sampol mang’eny ochoki kuom jatuwo achiel (kaka ascites kod tumor), watiyo gi test mar t ma oriw kata keto jatuwo kaka gik ma ok owinjore e ranyisi ma ng’ato ka ng’ato nyalo ng’ado kata ma ng’ato nyalo ng’ado kaka owinjore. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik ma ng’ato timo, temo mar ber itimo e yore adek.
Mondo iyud gik ma medore mag ndiko maeni, yie mondo iyud gik ma medore e wi ndiko maeni.
Mae en ndiko ma ji duto nyalo yudo ma ipogo e bwo chike mag Ratiro mar Oganda ma Oken mar Ohala, ma oyiene tiyogo, keto kendo loso e yo moro amora, mak mana ka tiyo kode mogik ok en mar yudo ber mar ohala kendo ma ng’ato nyalo ng’eyo ni tich ma ne ondik mokuongo en adier. Rango.
Par niya: Wakwayi mana ni imi adres mari mar e-mail mondo ng’at ma ioro e mbui ong’e ni idwaro ni one e-mailno kendo ni ok en e-mail ma ok owinjore. Ok wabi kawo adres moro amora mar e-mail.
Penjo ni itiyogo mar temo ka in jalendo kendo geng’o oro spam ma ok owinjore.
Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Rusel G. Jones), Fineas T. Hamilton (Fineas T.
MNA konyo e geng’o teko mar del mar T kendo ochung’ ne gik ma nyalo konyo e thieth mar kansa mar dhano.
Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Rusel G. Jones), Fineas T. Hamilton (Fineas T.
MNA konyo e geng’o teko mar del mar T kendo ochung’ ne gik ma nyalo konyo e thieth mar kansa mar dhano.
©2021 Riwruok mar Amerka mar Dongruok mar Sayans. ratiro duto oriti. AAAS en jahera mar Hinari, Agora, Oare, Chorus, Clocks, CrossRef kod counter. 2375-2548, Dhi nyime mar Sayans.