Protin ma ng’ato nyalo ng’ado e yo ma ng’ato goloe en gima dwarore ahinya e rito ng’injo mar selo kod ng’injo mar selo. Kaachiel gi ng’ado gik moko ka itiyo gi shell, tich ma lipids timo e ng’ado gik moko e kinesin e yor tero gik ma ng’ato nyalo ng’ado en penjo maduong’ ma osebedo ka penjore kuom kinde malach ma pok oyud dwoko. Kae, watimo 3D e kinde achiel ma nigi rangi mang’eny ma nigi rang’iny mamalo mar picha mar kinde adier mondo wanyis e ngima ni protin ma oseloso manyien ma nigi ng’injo mabor ahinya mag lipid mag ceramide ochokore kendo oketgi e endoplasms makende kaluwore gi kar wuok mar protin, ma en. Kaachiel gi mago, wanyiso ni bor mar ng’injo mar ceramide e ng’injo mar ng’injo mar endoplasm en gima duong’ ahinya e yiero ma kamago. <2Zepa> Nonro marwa chiwo neno mokuongo ma achiel kachiel e vivo mar pogo gik ma nigi protin kaluwore gi bor mar ng’injo mar lipid e kuonde ma oyier mag orogi oko e yo ma ng’ato nyalo ng’iewogo gik moko.
E sel mag eukaryote, bang’e, protin ma olosi e sel mag del (ER) ipogo e kinde ma iterogi kokalo kuom yo ma ng’ato nyalo ng’adogo gik moko mondo otergi kama owinjore gi sel (1). Kaachiel gi ng’ado bura ka itiyo gi koti, ne ipare kuom kinde malach ni lipid moko bende nyalo tiyo kaka yore mag wuok ma ng’ato nyalo yiero kuom ketogi e kambi mopogore opogore ma ng’ato nyalo ng’adoe bura (2-5). Kata kamano, pod onge gik ma nyiso ni nyalo bedo ni ng’ato nyalo timo kamano nikech lipid. Mondo wabed gi nyalo mar tieko chandruok maduong’ni, ne wapuonjore e yisti kaka gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato nyalo ng’ado bura mopogore opogore ka owuok e ER. GPI-APs gin gik ma opogore opogore ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato ( 6, 7 ). GPI-AP en protin ma wuok oko ma oriwre e ng’injo ma oko mar plasma kokalo kuom ng’injo ma nigi ng’injo (anchor mar GPI). Giyie gi ng’ado GPI kaka lokruok ma ng’ato timo bang’ loko dhok e lumen mar ER (8). Bang’ ka oseketgi, GPI-AP kalo e gigo ma iluongo ni Golgi (5, 9) kowuok e ER nyaka e ng’ut plasma. Ka nitie gik ma rito GPI, mano miyo GPI-AP tero mopogore gi gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre (moriwo nyaka gik mamoko ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre) e yo ma ng’ato nyalo ng’adogo (5, 9, 10). E sel mag yisti, GPI-APs ipogo gi protin mamoko ma igolo e ng’ut ng’ato, kae to iketogi e ng’ut ng’ato makende ma oum gi ng’ut ng’ato ma nigi ng’ut ng’ato (COPII) (6, 7). Gik ma ng’ado bura kuom yo mar keto gik moko e kidienje ma kamago e yo mar oro ER oko ok ong’ere maber, kata kamano, iparo ni yo ma kamano nyalo dwaro ni ng’ato oket lipid, ahinya ahinya loso kendo ng’et lipid mar ng’injo mar GPI (5, 8). E yisti, loso lipid mag GPI chakore mapiyo bang’ ka GPI osedonjore, kendo e kinde mang’eny, mano miyo ceramide tudruok gi asidi ma nigi mo ma nigi ng’injo mabor ma nigi karbon 26 (C26:0) (11, 12). C26 en seramid maduong’ ma sel mag yisti loso nyaka sani. Oloso e ER kendo thothne ioro e masin mar Golgi kokalo kuom ng’injo mag COPII (13). 14, 15), kendo e yo machielo, loko gik ma ng’ato nyalo ng’ado mondo obed ng’at ma ng’ado bura (IPC) e masin mar Golgi luwore gi loso gik ma ng’ato nyalo ng’ado (16). 17, 18:17, 18. 17:18, 17. 18 Gik ma ng’ato nyalo timo ka otiyo gi gik ma ng’ato oloso, osenyiso ni gik ma ng’ato nyalo timo mabor ahinya nyalo riwre mondo olos gik ma oketgi e rang’iny ma nigi gik ma opogore opogore mag ringruok (17, 18). <2Zepa> Data gi miyo ji bedo gi paro ni C26 kod GPI-AP ma nigi C26 tiyo kod gik ma gin-go mag ringruok mondo gibed kanyachiel e kuonde ma nigi chenro kata kuonde ma ni e alwora ma nigi lipid mag ER ma nigi ng’injo. Oting’o ahinya gik ma nigi ng’injo machuok kendo ma ok opong’ (C16:1 kod C18:1) (19, 20). Oganda ma kamago biro keto pachgi kuom kuonde ma ER wuokie (ERES), kama GPI-AP ma nigi ng’injo kod ng’injo nyalo terore kanyachiel nyaka e Golgi e ng’injo achiel ma ochung’ne COPII (5).
E somoni, wasetemo achiel kachiel yo ma luwore gi lipid kuom tiyo kod gino ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo (SCLIM), ma en yo ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo e kinde achiel. (21, 22).
Ne watiyo gi teknoloji mar SCLIM mokwongo mondo wamed nyiso kaka GPI-AP ma ng’ato nyalo ng’iyo gi grup mar C26 ne otim nonro kuom gik ma ng’ato nyalo ng’ado bang’ wuok e ER e S. Mondo wabed gi ng’eyo kuom kaka ER opogore, ne watiyo gi sistem mar genes ma nyalo neno e yo makare gik ma oseloso manyien ma donjo e ERES e ringruok (7, 23). Kaka mtoka, ne wayiero C26 ma nigi ng’injo mar GPI-AP Gas1 ma ondiki gi protin ma rieny (GFP) kod protin ma ng’injo ma ng’injo (iRFP) ma ng’injo ma ng’injo (iRFP) ma ng’injo ma ng’injo (iRFP) ma ng’injo ma ng’injo (iRFP) ma ng’injo ma ng’injo nyalo ng’injo (iRFP) ma gin gik ma ng’injo ma ng’injo (24-26). E sec31-1 ma ng’ato nyalo ng’iyo gi ng’ich, gik ariyogi inyiso e bwo ng’at ma nyalo kelo galaktos kod ng’at ma nyalo kelo ng’ich mar ERES. 37°C), nikech ng’injo mar sec31-1 ketho tich mar ng’injo mar COPII mar geng’o dongruok mar COPII kod ng’injo mar ER ma oko, gik ma oseloso manyien chokore e ER (23). Bang’ ka osebedo ka ng’ich nyaka e ng’ich ma piny (24°C), sel ma ne olokore mag sec31-1 ne oyudo dwoko maber e kama ne giwuoke, kendo gik manyien ma ne ochokore ne ochako tero oko mar ER. CLIM ne oneno ni thoth gik ma ne olosi manyien pod ne ochokore e ER mar sec31-1 ma ne olokore bang’ ka oseketgi e 37°C kae to ne giwegi e 24°C kuom dakika 5 (Fweny 1). Kaka Mid2-iRFP ipogo e wi ng’injo duto mar ER, to Gas1-GFP ipogore kendo ochokore e alwora mar ng’injo mar ER ma ok dhi nyime, ng’injogi opogore chuth (Fweny 1, A nyaka C kod Filim S1). Bende, kaka onyis e ranyisi mar 1D, ng’injo mar Gas1-GFP ok nigi Mid2-iRFP. Gik ma ne oyudrego nyiso ni GPI-AP kod protin ma ne okalo e ng’ut ng’ato ne opogore opogore e kuonde mopogore opogore mag ng’ut ng’ato e kinde motelo. 13:10, 11. 10 13 (Fweny 1, E kod F, kod sinema S1) (23).
AP, ralum) kod protin ma ng’ato nyalo ng’adogo ng’ato (TMP, marambulu) dakika 5, ne oter nyaka 24°C, kendo ne otim picha gi SCLIM bang’ dakika 5. (A nyaka C) nyiso picha ma 2D ma oriw kata ma achiel mar ndege (A), picha mar 2D ma nyiso gik ma 10 z (B) kata picha mar 3D ma nyiso gik ma ng’ato oting’o kod gik ma nyiso ERES (C). 1μm (A kod B). Gima ng’ato nyalo ng’ado en 0.551 μm (C). 1-GFP ne oyudre e kuonde mopogore opogore mag ER kata e grup mopogore opogore, to Mid2-iRFP ne oyudre kendo ne okethore e ng’et ER duto (C). (D) Graf nyiso kaka ler ma ng’ato nyalo ng’iyogo nyalo bedo gi teko mar ng’iyo gik moko e kind ng’ato gi ng’ato e grup mar ng’ato ka ng’ato e laini ma rachar (e korka achich). AU, yunit ma ok owinjore. (E kod F) nyiso picha mar 3D ma riwo gik moko kod ranyisi mar ERES. 1-GFP ne oyudre machiegni gi ERES makende. Gima ng’ato nyalo ng’ado en 0.551 μm. (F) Achiel ma rachar ma nigi ng’injo nyiso ng’injo mar Gas1-GFP ma tudruok gi ERES. Panel ma diere kod ma korka achich nyiso picha mar 3D ma omedore ma oriw kendo neno ma olokore mar ng’injo mar Gas1-GFP ma oyier.
1-GFP nyalo donjo e ERES ma ng’ato nyalo yiero, ma opogore gi yiero ma Mid2-iRFP tiyogo mar wuok e ER. Mondo wabed gi nyalo mar timo kamano, ne wapimo kwan mar ERES mar gimoro achiel kata ariyo kende (Fweny 2, A nyaka C). Ne wayudo ni thoth ERES (70%) nigi kit mtoka achiel kende. 2C nyiso ranyisi ariyo ma pile mag ERES ma nigi mana Gas1-GFP (ranyisi 1) kata Mid2-iRFP kende (ranyisi 2). Ka ipimo gi mano, chiegni 20% mar ERES nigi gik ariyo ma ng’ato ka ng’ato nyalo ng’ado e alwora achiel. Ne oyudre ni ERES moko (10%) ne nigi gik moko ariyo ma ne giting’o, to ne giketogi mopogore opogore e kuonde ma ne nenore maler ni ne opogore opogore. Omiyo, ng’iyo mar kwan maeni nyiso ni bang’ ka ER oseoro oko mar piny, GPI-AP Gas1-GFP kod gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato, opogore opogore e ERES mopogore opogore (Fweny 2D). Okang’ mar keto gik moko e kindgi luwore ahinya gi nonro ma ne otim chon mar gik ma ngima (6) kod ng’eyo kaka gik moko chalo (7). Bende wanyalo neno kaka gik ma oketgi e kwan ma donjo e ERES timore (Fweny 2E kod Filim S2). 2E nyiso ni mana ng’injo matin mar Gas1-GFP (panel mar 3) kata Mid2-iRFP (panel mar 4) ema donjo e ERES kowuok e bath ng’et achiel kendo ochung’ e kama opogore. 2E nyiso ni kinde moko yudore e ERES achiel, to gidonjo ka giwuok e bathe mopogore opogore kendo gichokore e kuonde mopogore opogore ma nyalo nyiso ng’injo mopogore opogore mag COPII. Bende, ne wajiwo ni pogruok ma ne oneno kendo keto e kidienje mopogore opogore mag GPI-AP Gas1 kaka ERES ma oyier en gima ng’ato nyalo ng’eyo nikech ng’at machielo ma ng’ado ng’ut ng’ato, ma en ng’at ma ng’ado ng’ut ng’ato ma nigi ng’ut ma ng’ato nyalo ng’ado, ma nyiso tim ma chal gi mar Mid2-iRFP. (Picha S1 kod Filim S3). <2Zepa> Axl2-GFP ma oseloso manyien ipogo kokalo kuom ng’injo mar ER kaka Mid2-iRFP (Fweny S1, A kod B), kendo ochung’ kanyachiel gi Mid2-iRFP e ERES mang’eny (Fweny S1, B nyaka D). Panel 1 kod 2 mag Ranyisi 1. S1C nyiso ranyisi ariyo ma pile mag ERES kama gik ariyo ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato ng’adoe. E wechegi, gik moko ariyogo duto donjo e ERES kanyachiel (Fweny S1E, Panel 3 kod Filim S3).
Bang’ keto gik ma ok nyal kelo ng’injo, Gas1-GFP (GPI-AP, ralum) kod Mid2-iRFP (TMP, marambulu) kod ERES ma keto nying’ mar ERES (ERES, magenta) ne oketgi e 37 Bang’ keto gik moko e 37 °C nyaka dakika 30 °C. ng’ado bura, kendo ng’ado picha gi SCLIM bang’ dakika 20. (A nyaka C) Piche ma nyiso 2D (A; ng’injo mar ng’injo, 1μm) kata piche mag ng’injo mar 3D (B kod C; ng’injo mar ng’injo, 0.456μm) mag gik ma oting’o kod ng’injo 10 mag z ma ondiki gi ERES. Oboke ma piny e (B) kod oboke ma ni e (C) nyiso piche ma olosi mondo onyis mana gik ma nitie e ERES (rangi makwar) [Gas1-GFP (rangi makwar) kod Mid2-iRFP (rangi makwar)]. (C) Achiel ma oyawore: ERES ting’o mana ng’injo achiel (1 nyaka 4). Asere ma rachar: ERES nigi gik ma opogore opogore (5). Asere ma rachar: ERES ma nigi gik ma oting’o e kanyachiel. E piny: ERES achiel ma oyier nigi mana gas 1-GFP (1) kata Mid2-iRFP (2). Bar mar pim, 100 nm. (D) Kwan ma ng’ato nyalo ng’eyogo picha ma olero e (C). ERES ma nigi ng’injo achiel kende (Gas1-GFP kata Mid2-iRFP), ng’injo ma opogore opogore kod ng’injo ma pong’o ng’injo. E temo adek ma ne otim gi ng’ato ka ng’ato, n = 432 e sel 54. Bar mar ketho = SD. Test mar t ma ok oket gi ng’ut ariyo. *** P = 0,0002. (E) Picha mar 3D mar ERES moyier mar gik ma oketgi e kwan ma ondiki gi (C). 1-GFP (ma ralum) (3) kata Mid2-iRFP (ma ralum) (4) donjo e ERES (ma ralum) kowuok e bath ng’ato achiel kendo ochung’ mana e kama matin ei ERES. Seche moko, kit gik moko ariyogo duto donjo e ERES achiel (5) ka giwuok e bath ng’ato achiel kendo gibedo e kama opogore ahinya e kind ERES. Bar mar pim, 100 nm.
Bang’e, ne watemo paro ma ne wacho ni ng’injo mabor mar acyl (C26) ma ni e ng’injo mar ER miyo ng’injo ma ng’ato nyalo ng’injo kendo ng’injo mar Gas1 bedo ERES ma oyier. Kaka ng’ato nyalo timo kamano, ne watiyo gi kit yisti ma ne oloki GhLag1, ma ne oloki gi GhLag1 (ma en kit yisti ma ng’ato nyalo ng’ado e iye), ma ne omiyo kit yisti ma nigi ng’injo mar sel matin moloyo kit yisti ma ng’injo mar ng’injo (Fweny 3A) (2). 95% mar ng’injo duto gin ng’injo mabor ahinya (C26), to e GhLag1, 85% mar ng’injo mabor ahinya (C18 kod C16). ), mana 2% mar seramid en seramid ma nigi ng’injo mabor ahinya (C26). Kata obedo ni C18 kod C16 gin gik madongo ma ne oyudre e ng’injo mar GhLag1 nyaka sani, nonro mar MS bende nonyiso ni ng’injo mar GPI mar Gas1-GFP ma inyiso e ng’injo mar GhLag1 nigi ng’injo mar C26, ma nyalo pimo gi gik ma ng’injo mag ng’injo mag bungu. <2Zepa> Kido mar ng’ato en mana maromre (Fweny 3A) (26). Omiyo, mano nyiso ni enzyme ma loso ng’injo mar Cwh43 en ng’at ma yiero ahinya ng’injo mar C26, kaka onyis e ranyisi mar 26, ohero keto ng’injo mar GPI kowuok kuom ng’injo matin mar C26 e kit GhLag1. S2 (29). Kata kamano, ng’injo mar GhLag1 nigi mana gik ma nyalo miyo ng’ato obed gi nyalo mar timo gik moko, to Gas1-GFP pod nigi gik ma nyalo miyo ng’ato obed gi nyalo mar timo gik moko. <2Zepa> Adiera ma kamano miyo ng’atno bedo gi tich maber ahinya mar tieko chandruok mar ng’injo mar acyl ma ng’injo mar ng’injo mar ng’injo e ER. Tich ma iparo ni klas kod ng’ado bura timo. Kae to, ne wapuonjore mokwongo nyalo ma C26 Gas1-GFP nigo mar chokore e grube ma ni e GhLag1 gi allele ma nyalo lokore gi ng’ich mar sec31-1 kokalo kuom ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo, kama mana ng’injo mabor (C18-C16) nitie e ng’injo mar ER (Fweny 3). Ne waneno ni e sec31-1, thoth Gas1-GFP ne opong’ e grup, to Gas1-GFP e sec31-1 GhLag1 ma nigi ng’injo mabor (C18-C16) mabor mar ER ne ok opong’ ahinya kendo ne opogore opogore e E ng’injo duto mar ER. Ka wabedo jo adier, nikech ng’injo ma luwore gi C26 nigi tudruok machiegni ahinya gi ERES makende (Fweny 1), bang’e ne watimo nonro mondo wane ka be yo ma kamano bende nyalo oriwo tich mar yo ma ER orogo protin oko. GPI-AP tiyo kod sistem makende mar COPII mar oro ER oko, ma ochung’ motegno gi Ted1 ′s loso kendo mar glycan mar ng’injo mar GPI (30, 31). 10:10, 11. 10 Kae to ng’at ma nigi ng’injo mar GPI-glycan ong’ere gi p24 ma ng’ato nyalo ng’adogo ng’ato, ma bang’e ng’ado Lst1, ma en isoform makende mar ng’injo maduong’ mar COPII ma ng’ato nyalo ng’iewogo ng’ato, ma miyo ng’ato bedo gi ng’injo maduong’ mar COPII. Kuom mano, ne waloso ng’at ma nyalo lokore ariyo ma ne oriwo golo gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wigi (ng’at ma nigi p24 ma ng’ato nyalo ng’ado, enzyme ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato, kod ng’at ma ng’ado bura ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato) gi ng’at ma ng’ado bura ma ng’ato nyalo ng’ado, kendo ne wapuonjoregi. Ne waneno ni e seche 31-1-14Δ kod seche 31-1Δ, Gas1-GFP ok opong’ ahinya kendo opogore opogore e ER membrane duto, kaka ne oneno chon e seche 31-1 GhLag1, to e seche 31-1lst1Δ, Gas1-GFP chalo gi seche 3. <2Zepa> 10:10, 11. 10 Gik ma ne otimorego nyiso ni, ka ok oting’o bedo gi C26 e ng’injo mar ER, ng’injo mar Gas1-GFP bende dwaro ni oriwre gi p24, kendo ok odwarre ni Lst1 oket ng’injo makende. Kae to, ne wanono kaka nyalo bedo ni bor mar ng’injo mar ER nyalo rito tudruok mar Gas1-GFP gi p24. Kata kamano, ne wayudo ni bedo gi ng’injo mar C18-C16 e ng’injo ok keth GPI-glikan ma p24 oloso kendo (Fweny S3 kod S4, A kod B) kata tudruok gi GPI-AP kendo oro GPI-AP oko. nyalo. <2Zepa> 1:10, 11. 10 (Fweny S4C) Omiyo, ng’ado bura ma luwore gi ceramide mar C26 ok dwaro ni protin otim tudruok gi yore mopogore opogore mag ER ma oro protin oko, to ochung’ ne yo machielo mar ng’ado bura ma riembo gi bor mar lipid. Kae to, ne wanono ka be ng’injo mar ng’injo mar ER en gima duong’ ahinya e ng’injo maber mar Gas1-GFP kaka ERES ma yiero. Kaka Gas1 e ng’injo mar GhLag1 ma nigi ng’injo matin wuok e ER kendo odonjo e ng’injo mar plasma (Fweny S5), wayie ni ka ng’injono ochung’ne bor mar ng’injo mar acyl, Gas1 ma ni e ng’injo mar GhLag1 nyalo dwokore kendo ng’injo. ERES gik ma nigi ng’injo maromre.
(A) Ng’injo mar GhLag1 thothne nigi gik matin ma C18-C16, to ng’injo mar GPI mar Gas1-GFP pod nigi IPC marom gi mar sel ma ng’injo mag bungu. Oboke: ng’iyo bor mar ng’injo mar acyl e ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo (MS). Data no ochung’ ne kwan mar seramide duto. Average mar temo adek ma ng’ato ka ng’ato otimo kendgi. Bar mar ketho = SD. Test mar t ma ok oket gi ng’ut ariyo. **** p <0,0001. MS ng’iyo bor mar ng’injo mar acyl mar IPC ma nitie e ng’injo mar GPI ma inyiso e ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar GhLag1p. Data ochung’ ne kwan mar signal mar IPC duto. Kidieny mar temo abich ma ng’ato ka ng’ato otimo kendgi. Bar mar ketho = SD. Test mar t ma ok oket gi ng’ut ariyo. ns, ok en gima duong’. p = 0,9134. (B) Mikrograf mag ler mag sec 31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ kod sec31-1lst1Δ kod sec31-1lst1Δ ma nyiso galaktose ma kelo Gas1-GFP ne oketgi piny e 37°C kuom dakika 30. bang’ 24°C. Asere marachar: Grup mar ER Gas1-GFP. 1-GFP ma ok oting’o ng’injo ipogo e wi ng’injo duto mar ER, ma nyiso ni ER nigi kido mar ng’injo mar nuklia. Bar mar pim, 5μm. (C) Kwan ma ng’ato nyalo ng’eyogo picha ma olero e (B). Oganda mathoth ma nigi ng’injo mar Gas1-GFP. E temo adek ma ng’ato ka ng’ato otimo, n≥300 mag sel. Bar mar ketho = SD. Test mar t ma ok oket gi ng’ut ariyo. **** p <0,0001.
10:10, 11. 10 Kaka ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nigi ng’eyo matut kuom ng’ato, ne en ng’at ma ng’iyo gik moko e yo ma ok owinjore (Fweny 4 kod Filim S4). Bang’ ka ER oseket e 37°C kendo bang’e ogol e 24°C, thoth Gas1-GFP ma ne olosi manyien ne ok ochokore kendo ne okethore e ng’et ER duto, kaka ne oneno gi gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik matin (Fweny 4, A kod B ). Kaachiel gi mago, kwan maduong’ mar ERES (67%) oriwo kit gik moko ariyo ma ng’ato nyalo ting’o kanyachiel e iye (Fweny 4D). kod 2 mag ranyisi mar 4C nyiso ranyisi ariyo ma pile mag ERES ma nigi gas 1-GFP kod Mid2-GFP ma ng’ato ka ng’ato nyalo ng’ado. Kaachiel gi mago, gik moko ariyogo duto ne oketgi e ERES achiel (Fweny 4E, panel 3 kod sinema S4). Omiyo, duoko ma wayudo nyiso ni bor mar ng’injo mar acyl ma ni e ng’injo mar ER en gima duong’ ma ng’ado bura kuom kaka protin mag ER biro chokore kendo ketogi e kidienje mopogore opogore.
13-GFP (GPI-AP, ralum) kod Mid2-iRFP (TMP, rambulu) kod gik ma ERES ma nigi ranyisi mar ERES (ERES, makwar) Keto e 37°C. Dhi nyime kuom dakika 30, dwoko piny nyaka 24°C mondo ogol gik ma ng’ato oting’o, kendo ng’ad picha gi SCLIM bang’ dakika 20. (A nyaka C) Piche mag 2D ma nyiso gik moko (A; rang’iny mar 1 μm) kata piche mag 3D mag ng’injo mag sel (B kod C; rang’iny mar ng’injo, 0.45 μm) mag z-seche 10 ma ondiki gi gik ma oting’o kod ERES. Oboke ma piny e (B) kod oboke ma ni e (C) nyiso piche ma olosi mondo onyis mana gik ma nitie e ERES (rangi makwar) [Gas1-GFP (rangi makwar) kod Mid2-iRFP (rangi makwar)]. (C) Asere ma opong’ gi rangi marachar: ERES, gik ma ng’ato oting’o. Oboke ma oyawore: ERES nigi gimoro achiel kende. Panel ma piny: ERES ma oyier nigi gik ma pong’o (1 kod 2) ma ondiki e (C). Bar mar pim, 100 nm. (D) Kwan ma ng’ato nyalo ng’eyogo picha ma olero e (C). 1-1-1-1, 10:10, 11. 10 E mtoka achiel kende (Gas1-GFP kata Mid2-iRFP) ema oting’o, kendo kwan mar ERES ma ng’ato nyalo ng’iewogo gik moko ma opogore opogore kod gik ma ng’ato nyalo ting’o ma ng’ato nyalo ng’iewogo. E temo adek ma ne otim gi ng’ato ka ng’ato, n = 432 e sel 54 (seche 31-1) kod n = 430 e sel 47 (seche 31-1 GhLag1). Bar mar ketho = SD. Test mar t ma ok oket gi ng’ut ariyo. *** p = 0,0002 (sekon 31-1) kod ** p = 0,0031 (sekon 31-1). (E) Picha mar 3D mar ERES moyier ma nigi gik ma opong’o (3) ma ondiki e (C). 1-GFP (ma ralum) kod Mid2-iRFP (ma ralum) chopo machiegni gi ERES (ma ralum) ka giwuok e bath yo achiel kendo gibedo e kama achiel ma ERES ogeng’o. Bar mar pim, 100 nm.
<2Zepa> Nonro ni chiwo neno mowinjore e vivo ni gik ma nigi protin ma luwore gi lipid iketo e kuonde ma ji nyalo ng’iewoe gikmoko e yo ma ng’ato nyalo ng’iewogo gik moko, kendo onyiso ber mar bor mar ng’injo mar acyl mondo oketgi e kidienje mopogore opogore. Ka watiyo gi yo ma nigi teko kendo ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik madongo ma iluongo ni SCLIM, ne wanyiso ni Gas1-GFP ma oseloso manyien (GPI-AP maduong’ ma nigi ng’injo mabor ahinya mar acyl (C26) ma nigi ng’injo mabor ahinya) e yisti. ER ma ng’ato nyalo ng’ado (Fweny 1). Kaachiel gi mago, kit gik moko ariyogi donjo e ERES mopogore opogore ka giyiero (Fweny 2). 18-C16, ng’injo mar Gas1-GFP okethore e alwora mar ER ma opogore opogore, kendo Gas1-GFP dwokore mondo owuok e ER gi protin ma ng’injono ng’injo kokalo kuom ERES maromre (Fweny 3 kod Fweny 3). 4).
Kata obedo ni GPI-AP tiyo kod yo makende mar protin mondo owuok e ER, ne wayudo ni pogruok ma luwore gi C26 ok luwore gi tudruok mopogore opogore mag protin ma nyalo miyo ERES obed makende (Fweny S4 kod S5). To, gik ma wayudo siro yo machielo mar keto gik moko e kidienje mopogore opogore ma itiyogo gi ng’injo mar protin ma luwore gi lipid kendo bang’e weyo gik mamoko ma ng’ato ting’o. 10:10, 11. 10 Gik ma ne waneno nyiso ni ng’et Gas1-GFP kata grup ma tudruok gi ERES moro onge gi protin ma ng’ato nyalo ng’ado e del ma iluongo ni Mid2-iRFP, ma nyiso ni grup mar GPI-AP ma luwore gi C26 biro konyogi mondo gidonj e ERES ma owinjore, kendo e kinde marom, golo oko gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre ng’ato ( 2). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo ni, bedo ni nitie gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ER ok mi GPI-AP olos kuonde kata grube, omiyo ok gigol oko kata giket kar gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ERES maromre (Fweny 3 kod 4). . Omiyo, waparo ni C26 miyo ng’ato bedo gi pogruok kendo ng’ado bura kuom konyo e loso gik ma ng’ato nyalo ng’ado e kind protin ma tudruok gi ERES makende.
Ere kaka inyalo chopo ng’injo ma luwore gi C26 e alwora moro makende mar ER? Kaka ng’ato nyalo ng’ado bura, mano nyalo miyo GPI-AP kod C26 olos ng’injo matin kendo ma ochung’ne ng’injo mapiyo e alwora ma ng’injo ma ok ng’injo ahinya e ng’injo mar ER ma nigi ng’injo matin kendo ma ok opong’. Grube mag ng’eyo (17, 18). Gik matin ma ng’ato nyalo timo kuom thuolo matin nyalo medore mondo obed gik madongo kendo ma ok ng’ich bang’ ka gisetudore gi p24 (34). Kaluwore gi wachni, ne wanyiso ni C26 Gas1-GFP dwaro tudruok gi p24 mondo olos grube madongo ma nenore (Fweny 3). p24 en oligomer ma ok opogore opogore ma oting’o protin ang’wen mopogore opogore mag p24 ma ng’ato nyalo ng’ado e yisti (35), ma miyo tudruok ma nigi ng’injo mang’eny, ma nyalo miyo ng’ato obed gi tudruok e kind ng’injo matindo mag GPI-AP, ma miyo ng’injo maduong’ mar Stable bedo gi ng’injo maduong’ (34). <2Zepa> Riwruok e kind protin mag GPI-APs bende nyalo konyo e losogi, kaka onyis e kinde ma giterogi e Golgi e sel mag ng’ut ma ng’ato nyalo ng’iyogo (36). Kata kamano, ka C18-C16 nitie e ng’injo mar ER, ka p24 ma ng’injono oriwre gi Gas1-GFP, ok bi bedo gi grube madongo mopogore opogore. Oboke ma ng’ato nyalo timo nyalo luwore gi gik ma ng’ato timo e ringre kod e kemikol ma ng’ato nigo ma nigi ng’injo mabor mar acyl. <2Zepa> 18-C16 nyiso ni kata obedo ni ng’injo mabor (C24) kod matin (C18-C16) nyalo kelo pogruok mar phase, en mana ng’injo mabor (C24) ema nyalo kelo ng’injo ma malo kod ng’injo ma ng’injo ma ng’injo nyalo kelo ng’injo ma malo mondo olos filim. Kokalo kuom loso gik moko e kindgi (17, 37, 38). Ne onyiso ni TMED2, ma en ng’at ma chal gi Emp24, nyalo tudruok gi ng’at ma nigi ng’ut ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato (39). Ka watiyo gi ranyisi mag ng’iyo gik ma ng’ato timo (MD), ne wayudo ni gik moko ariyo ma C18 kod C26 chokore e alwora mar ng’injo mag ng’injo mag Emp24, kendo gin gi gombo machalre (Fweny S6). En gima ber ng’eyo ni mano nyiso ni helix ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato nyalo miyo ng’ato obed gi ng’iyo ma ok owinjore. Mae en duoko ma oseyudore machiegni kaluwore gi sel mag le ma nigi lak. MD ma chal gi mago bende nyiso ni nitie lipid mag eter (40) . Omiyo, waparo ni C26 ma ni e ng’injo ariyo mag ER26 en gik ma nigi ng’injo e alwora. Ka GPI-AP e ng’ut ng’ato otudore achiel kachiel gi p24 ma nigi ng’injo mang’eny kendo ng’injo mar C26 ma ni e alwora mar p24 e ng’injo mag sitoplasma, mano nyalo konyo e loso gik ma luwogi mag protin kendo ng’injo mag membrane yudore kokalo kuom lith lwedo (41), ma miyo GPI-AP bedo gi ng’injo ma malo bende bedo gi ng’injo mopogore opogore. ng’eny mag ER (42). Ripot motelo ne siro yo ma ne oketno ( 43, 44 ). <2Zepa> 10:10, 11. 10 Kaka ng’ato nyalo ng’ado bura e wi ng’injo mar plasma, mano miyo ng’ato bedo gi ng’injo maduong’ mar GSL, kendo mano miyo ng’injono bedo gi ng’injo maduong’ kendo miyo ng’injono bedo gi ng’injo kendo bedo e iye (44). (43) Ne oyudre ni ka nitie ng’injo mabor (C24) to ok matin (C16), ligand ma nigi ng’injo mang’eny ma oriwre gi GSL lactosylceramide ne omiyo oloso grube madongo kendo ng’injo mag membrane, kendo ng’injo ma ng’injo ma ng’injo ma ng’injogo ng’ado e wi ng’injo ma ng’injono kelo.
10, 45: 10:10, 11. 10 E sel mag ng’ut ma nigi ng’ut ma ng’ato nyalo ng’ado, ng’eny mar ng’ato ma nigi ng’ut ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato (TGN) nyaka e rang’iny mar ng’at ma nigi ng’ut ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato, e ma rito pogruok kod ng’ado mar GPI-AP (10, 45). <2Zepa> 36, kata kamano, nyalo bende luwore gi bor mar ng’injo ma wayudo e yisti. Kata obedo ni GPI-AP mar le madongo nigi ng’injo ma luwore gi lipid mag ether, kendo loso mare mar kemikol opogore ahinya gi ng’injo mar acyl mabor ahinya, nonro moro ma osetim machiegni nofwenyo ni lipid ariyogo nigi gik ma chalre mag ringruok kod kemikol kendo tiyo (40). Omiyo, ng’et lipid ma ni e sel mag le ma nigi lak nyalo bedo kaka ng’injo mar C26 ma ni e yisti, kendo tije en tudruok gi ng’injo ma nigi ng’injo mabor ma ni e ng’injo mondo okony GPI-AP mondo ochokore kendo oketgi mopogore opogore. Kata obedo ni nyalo ma kamano pod dwarore ni otem achiel kachiel, gik ma oseyudore chon siro ni tero mar ng’injo mabor mar acyl nyaka e ringruok mar Golgi ok timre gi protin ma tero ng’injo mar ng’injo mar ng’injo, to luwore gi loso mar ng’injo mag GPI kaka yisti. 13:16, 20, 46, 47) 13, 16, 20, 46, 47) e ng’injo achiel mar tero gik moko.
E yisti kod sistem mag sel mag ng’ut ma nigi ng’injo, ng’injo mar GPI-AP kod pogruok gi protin mamoko mag plasma duto timore kapok ochopo e wi sel. Paladino kod jowetene. ( 48 ) Ne oyudo ni e TGN mar ng’injo mag le ma ng’injo, ng’injo mar GPI-AP ok en mana gima dwarore mondo oket GPI-APs e ng’injo mar plasma ma malo, to bende ochung’ ne ng’injo mar GPI-APs kod tije mag ngima. Oboke mar sel. E yisti, nonro ni nonyiso ni ng’injo mar GPI-AP ma luwore gi C26 ma ni e ER nyalo loso chenro mar ng’injono kod tije mag GPI-AP e wi ng’injo mar plasma (24, 49). Kaluwore gi ranyisi ma kamano, sel mag GhLag1 nigi alerji ne gik ma geng’o GPI kata yath ma ketho ler mar sel (28), kendo dwaro mar ng’injo mag Gas1-GFP ma tiyo (49) mag tip ceramide ma inyiso e tudruok mar sel mag yisti nyiso G Gik ma nyalo timore e ringruok mag h Lag1. Ketho mar GPI-AP. Kata kamano, temo mathoth mondo ong’e ka be chenro ma tiyo mar ng’ut sel oseket e program kowuok e ER kokalo kuom yo mar keto gik moko kaluwore gi bor mar lipid biro bedo wach ma wabiro timo nonro e kinde mabiro.
Gik ma itiyogo e tijni ondiki e Tebol S1. 1583 kod MMY1635 mag SCLIM ma ne itiyogo e ng’iyo gik ma ngima ne oger e ng’et W303. 13:10, 11. 13 Ne ogergi ka gitiyo gi yo ma ne itiyogo gi PCR ma ne nigi plasmid mar pFA6a kaka ranyisi (23). Oganda ma nyiso Mid2-iRFP ma ondiki gi protin ma rieny e bwo loch mar jalony mar GAL1 ne oger kaka luwogi. PCR medo mar ranyisi mar iRFP-KanMx kowuok e vector mar pKTiRFP-KAN (mich mar E. O'Shea, namba mar plasmid mar Addgene 64687; Bang’ ka ne osemed ng’injo mar genom mar Mid2-iRFP kendo oketgi e ng’injo mar GAL1, ne oketgi e kambi ma ok en mar I-Sac I mar plasmid mar keto pRS306. <2Zepa> Plasmid ma ne owuok e pRGS7 ne oketgi e rang’iny mar Pst I mondo odonjre e kar URA3.
1-GFP ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato, ng’ato nyalo ng’ado bura e bwo loch mar ng’at ma rito GAL1 e plasmid mar CEN, ma olosi kaka luwogi. (Mich mar L. Popolo) kendo ne oketgi e kambi mar Xma I-Xho I mar plasmid mar CEN (mich mar C). Milu; Namba mar plasmid mar adjen 51225; 51225; RRID: Medo _51225). Plasmid mane owuok ne omiye nying ni pRGS6. <2Zepa> 10:10, 11. 10 Bende, ng’at ma ng’ado bura mar ng’ado bura mar Axl2-GFP bende inyiso e bwo loch mar ng’at ma loso gik moko kaka GAL1, kendo kaka ogere en kaka luwogi. 23) plasmid mar pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) kokalo kuom PCR, kendo ne oketgi e kar Bam HI-Pst I mar pBEVY-GL LEU2 vector. Plasmid mane owuok ne omi nying ni pRGS12. Oganda ma ng’iyo gik moko ma ng’ato nyalo ng’iyogo, ondiki e Table S2.
Ne omedore gi 0.2% mar adenine kod 2% mar glukosis, 2% mar raffinose [YP-raffinose] ma nigi protin ma nigi yisti mang’eny (1 % mar yisti ma owuok e yisti kod 2% mar protin ma nigi yisti). (YPR)] kata 2% galaktoz [YP-galactose (YPG)] kaka gik ma kelo kabon, kata e gik ma olosi matin ahinya (0.15% mar yisti ma nigi natrojen kod 0.5% mar yisti ma nigi natrojen) mondo omed amino asidi mowinjore kod gik ma dwarore mondo ng’ato obed gi chiemo , Kendo nigi 2% mar glukoz kata glukoz matin ahinya ( (galaktos ma ng’ato oloso) kaka gik ma kelo kabon.
Kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik moko e kinde ma adier, ne odongo e YPR e 24 ° C ei otieno nyaka e kind ng’ato. Bang’ ketogi e YPG e 24°C kuom seche 1, ne iketo selgo e SG e 37°C kuom dakika 30, kae to ne iterogi e 24°C mondo ogol oko mar ng’injo. Ne otiyo gi konkanavalin A mondo oket selgo e wi ng’injo ma ne oting’o glas kendo ne otimnegi picha gi SCLIM. SCLIM en riwruok mar Olympus IX-71 ma riembo gik matin ma rieny kod lens mar mo ma nigi namba ma 100 × 1.4 (Olympus), gino ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik ma ng’ato nyalo ng’iyo gi ng’ato ka ng’ato (Yokogawa Electric kod gino ma ng’ato nyalo ng’iyo gi gik ma ng’ato dwaro). (Fotonik mar Hamamatsu) nyalo miyo ng’ato obed gi sistem mar lens ma medo gik ma nenore gi wang’ ma nigi nyalo mar medo gik moko madongo ma romo ×266.7 kod kamera ma nigi chaji ma nyalo medo gik ma nenore gi wang’e (21). Manyo picha itimore kokalo kuom program ma olosi kaka ng'ato owuon (Yokogawa Electric). Ka ne watiyo gi piche mag 3D, ne watiyo gi gimoro ma ne olosi kaka ng’ato dwaro mondo oting’ lens ma ne watiyogo e wang’e, kendo ne wachoko gik ma ne nenore gi wang’ ma ne ni kar 100 nm e kindgi e stek. <2Zepa> Picha mar Z-stack iloko obed data mar voxel mar 3D, kendo tich mar lando gik ma ng’ato nyalo ng’eyo ma itiyogo e ng’iyo gik ma ng’ato nyalo neno gi wang’e ma ng’ato nyalo neno gi wang’e ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik moko. Ka watiyo gi program mar Volocity mondo oket ng’wech mar ng’iyo kama ng’ato nitie, ne opim ERES moriwo nyaka gik ma ne oting’o. Ne otim nonro mar skan mar laini ka oti kod program mar MetaMorph (Gik ma itiyogo).
Ti kod program mar GraphPad Prism mondo ing'e ber mar kwan. Kaka t-test mar Japuonjre ma nigi ng’ut ariyo kod tes mar ng’iyo ng’ato achiel (ANOVA), pogruok e kind grup okawe ni nigi teko maduong’ kuom P <0.05 (*).
1-GFP, ne odongo e YPD ei otieno achiel kendo ne ochoki kuom ng’ado gik moko e yo ma ok owinjore, ne olose nyadi riyo gi saline ma nigi fosfet, kendo ne oketogi e wi baraf kuom dakika ma ok okalo 15, kae to ne gidhi nyime e bwo ng’iyo gik moko kaka ne oler motelo (24). 1003/1.40 oil PH3 CS) ma ne nigi lens ma neno gik moko, filta mar L5 (GFP), kamera mar Hamamatsu kod program mar ng’iyo gik moko ma ne itiyogo (LAS X) ne otigodo e yudo gik moko. .
Ne oket ranyisi mag SDS e 65°C kuom dakika 10, kae to ne opogore gi ranyisi mag SDS (PAGE). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik moko, ne oketo 10 μl mar sampul e laini ka laini. Gik ma geng’o tuoche: Ti kod gik ma geng’o tuoche ma ng’ato nyalo ng’ado e wi 1:3000, gik ma geng’o Emp24 e 1:500, kod gik ma geng’o ng’ato gi GFP (mich ma H. ​​Riezman oting’o) e 1:3000. Ne otiyo gi gik ma geng’o Pgk1 ma ne oting’o ng’injo ma romo 1:5000 (mich ma ne oa kuom J. Gima geng’o tuo mar ariyo: Gima geng’o tuo mar ng’ato ma nigi ng’injo mar ng’injo (HRP) ma itiyogo e ng’injo mar 1:3000 (Pierce). IgG ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ombe ma ne oting’o HRP ne otigodo e kwan mar 1:3000 (Pierce). Oganda ma ng’ato nyalo ng’ado bura ne ng’ato ka ng’ato kuom yo ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik ma nyalo ketho ringre ng’ato.
Kaka ne oler e (31), ne otim temo mar ng’ado ng’ut ng’ato e wi ng’injo mar ER ma ne opong’ gi ng’injo. E yo machuok, lwok sel mag yisti gi buffer mar TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenylmethylsulfonyl fluoride kod gik ma geng’o protease) e 600 nm (OD600) e 100 mM. Ne okethore gi gik ma ng’injo mag glas, kae to ne ogolo gik ma ne odong’ e sel kod gik ma ng’injo mag glas ka otiyo gi yo ma ne itiyogo gi ng’injo mar glas. Bang’e, ne oket pi ma ne odong’ e wi pino e g 17,000 kuom dakika 15 e 4°C. Ne oket peletno kendo e TNE kendo ne omed saponin ma ne oting’o 1% mogik. Ne oket gik ma ne ochung’ne ng’injono kuom seche 1 ka ilokogi e 4°C, kae to ne igolo gik ma ne ok nyal ng’injogo kuom ketogi e 13,000 g e 4°C kuom dakika 60. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nyalo ng’ado bura, mokwongo, ng’ato onego oket ng’injono e 4°C kuom seche 1, kae to oket ng’injono e 4°C kuom seche adek. Ne oloso gik ma ne okethore e del nyadibich gi TNE ma nigi 0.2% mar digoxigenin, ne oketgi gi buffer mar SDS, ne opogoregi e SDS-PAGE, kendo ne otimnegi nonro kokalo kuom ng’iyo gik ma ne nyalo ketho del.
Kaka ne oler e (31), ne otim ng’ado bura mar tudruok e wi ng’injo mar ER ma ne opong’ gi mwandu. E yo machuok, ng’injo mar ER ma ne opong’ gi 0.5 mM (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Amerka; 20°C, dakika 20). Ne oket glisin (50 mM mar ng’injo mogik, dakika 5, 20°C).
Kaka ne oler motelo (50), ne otim nonro mar MS mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar GhLag1. E yo machuok, ne odongo nyaka e rang’iny mar ng’eny (3 nyaka 4 mag OD600/ml) e YPD e 30°C, kendo ne ochoko sel 25×107. Gik ma giloso e ringregi weyo tiyo kod asid mar trikloroasetik. 15:15:5:1:0.018 v/v) kod 1.2 nmol mar ng’injo mar C17 (860517, Avanti polar lipid) ma nigi ng’injo ma iye. Ti kod gik ma nyalo miyo ng’ato obed gi ng’ol [metanol, pi, n-butanol kod ng’injo mar ng’injo (4:3:1:5 v/v)] mondo otim ng’injo matin mar gik ma owuok e iye, kae to ti kod n-butanol ma opong’ gi pi mondo ogol ng’injo. E giko, ne oket gik ma ne owuok e iye kendo e gimoro ma ne nyalo miyo ng’ato obed gi ng’eyo maber [kloroform/methanol/pi (2:7:1) + 5 mM ammonium asetat] kendo ne okete e gino ma ne itiyogo e ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo. Ne otim nonro mar gik ma ng’ato timo (MRM) mondo ong’e kendo opim kwan mar gik ma ng’ato timo. <2Zepa> TSQ Vantage ma nigi ng’injo mar ng’injo mar ng’injo (Thermo Fisher Scientific) nigi masin ma ng’injo mar ng’injo ma ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo. Teko mar ng’anjo oket maber ne kidieny ka kidieny mar seramide. Data mar MS ne oyudre e yo maber. Kuom dwoko moro ka moro mar gik ma ngima, ranyisi mar lipid en diere mar pim adek ma ok ochung’ kar ng’ato.
Kaka ne oler e (31), sel (800 × 107) ma ne nyiso Gas1-GFP ne otimnegi gik ma nyalo ketho ringruok. 1-GFP ma ne olosi ne opogore gi SDS-PAGE kendo ne oter e ng’injo ma ne nigi ng’injo mar ng’injo (PVDF). Protinno ne oneno gi wang’ kuom keto rangi makwar e PVDF. Ne ogol band mar Gas1-GFP kowuok e PVDF kendo olose nyadi 5 gi metanol kendo dichiel gi pi ma nigi rang’iny mar ng’iyo gik moko. Ka iketo ng’injo mar ng’injo gi 500 μl mar NaOAc (pH 4.0), buffer kod 500 μl mar ng’injo mar sodium nitrite 1 M ma oseyueyo mayom e 37°C kuom seche adek, ng’injo mar lipid igolo oko mar gas1-GFP kod inophaol ma ng’injo. (51). Bang’e, ne oloso ng’injono nyadi ang’wen gi pi ma nigi rang’iny mar LC-MS, ne otuogi e yamo ma ng’ich ahinya, kendo ne oketogi e yamo ma nigi natrojen ma nigi ng’ich mar -80°C nyaka ne otimnegi nonro. Kaka ranyisi, ne otiyo gi sampul ma onge gimoro ma ne oting’o ng’injo mar PVDF e temo ka temo. 10:10, 11. 10 Ne otim nonro kuom MS kaka ne olere (50). 1:2 + 5 mM ammonium asetate] kendo ne okalo e ng’iyo mar ng’injo mar ng’injo (ESI)-MRM/MS ng’iyo mar kit ng’injo mag ng’injo (TSQ Vantage). E yo ma kamano, weche mag MS ne oyudre e yo ma ok ber mar ion.
Kaka ne owach motelo, ng’et lipid ma ne ni e ng’injo mar GPI ne opogore gi ng’injo mar GPI ma ne ondikie ni [3H] (16). 10:45:10 Kloroform-methanol-0.25% KCl) kendo ne gineno gik moko ka gitiyo gi FLA-7000 (Fujifilm).
600×107) Ne oloso nyadi riyo gi ng’injo mar TNE ma nigi ng’injo mar TNE, kendo ne okethore gi gik ma ng’injo mag glas, kae to ne oketgi e kar ng’injo mondo ogol gik ma ng’injo mag glas kod gik ma ng’injo mag glas. Bang’e, ne oket pi ma ne odong’ e wi pino e g 17,000 kuom seche 1 e 4°C. Ne oloso ng’injono e TNE kendo oketgi e TNE ma nigi 0.2% mar saponin kuom seche 1 e 37°C. Bang’ tiyo kod enzyme, ne ogolo ng’injono kuom keto ng’injono e g 17,000 e 4°C kuom seche 1. Mondo oket gas 1-GFP ma nyalo geng’o tuoche, ne oketo gik ma ne ni e wi ng’ato gi ng’ato e 4°C kuom otieno duto. 1-GFP ma ne olosi ma ne opogore gi SDS-PAGE ne oket rangi ma bulu ma rieny mar Coomassie. Ne ogol band mar rangi mar Gas1-GFP kuom rangi ma ng’ich ma ne orumo ng’wech mar pi, kae to bang’ ka osetim alkylation gi iodoacetamide kendo dwoko piny gi dithiothreitol, ne otim ng’injo mar gel ka otiyo gi trypsin. Owuok kendo otur gik ma nyalo ketho del kod gik ma nigi GPI-glikan. Peptide ma ne otho ne oketgi e 20 μl mar pi. Inyalo keto ng’injo moro (8 μl) e LC. Ne otiyo gi ng’injo mar oktadecylsilane (ODS) (ODS) (ODS) (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; ng’injo ma iye ma romo milimita 150 × 1.0 milimita; Okang’ ma ng’ato nyalo ng’adogo bura en ng’at ma ng’ado bura A (0.08% asid mar formik) kod ng’ado bura B (0.15% asid mar formik e 80% asetonitril). Ne otiyo gi sistem mar Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) mondo ogol ng’injo mar ng’injo A ei dakika 55 e ng’injo mar 50 μl min-1 kuom dakika 5, kae to ne omed ng’injo mar ng’injo B nyaka 40%. , piny Amerka). Ne odhi nyime gi keto gik ma ne oting’o e ion mag ESI, kendo ne otim nonro kuom gik ma ne otimre gi LTQ Orbitrap XL (thermo Fisher Scientific). E chenro mar MS, ne iketo voltej mar ng’injo ma ne oting’o ng’injono e 4.5 kV, kendo ne iketo ng’injo mar ng’injo ma ne oting’o ng’injono e 300°C. Voltej mar kapilari kod voltej mar lens mar tipo ne oketi e 15 V kod 50 V, kaka giluwore. MS data ne oyudre e yo mar ion maber (ng’eyo mar 60,000; ng’eyo mar pek mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar 300/m/z ng’injo mar ng’injo/charge (m/z) 3000. ng’wech ma kelo ng’wech (CID)].
MD ne otim ranyisi ka oti kod program mar GROMACS (52) kod ng’wech mar teko mar Martini 2 (53-55). Bang’e, ne otiyo gi gino ma gero ng’injo mar CHARMM GUI (56, 57) mondo oger ng’injo ma nigi ng’injo ariyo ma nigi ng’injo ma nigi ng’injo ariyo (DOPC) kod Cer C18 kata DOPC kod Cer C26. Topoloji kod tudruok mag Cer C26 owuok kuom DXCE kuom golo gik ma medore e ng’ut ng’ato. Ti kod yo ma olero piny kae mondo ilos ng’injo ariyo kendo iti kodgi, kae to ti gi ng’injo mogik mag sistem mondo ilos sistem ma nigi Emp24. 173 nyaka 193) ne oger kaka α-helix ka otiyo gi gik ma nenore mag MD (VMD) ma ne ochung’ne loso gik moko (58). Kae to, bang’ golo gik ma ne oting’o ng’injo, ne oketo protinno e ng’injo ma ng’injo kendo ne okete e ng’injo ariyo ka otiyo gi GUI mar CHARMM. 1202 DOPC kod 302 C26 kata 1197 DOPC kod 295 Cer C18 kod Emp24. Ion sistem nyaka obed gi ng’injo mar 0.150M. Ne otim dwoko ang’wen ma ok ochung’ kar ng’ato ka ng’ato ne loso gik moko ariyo ma nigi ng’injo ariyo.
405,000, kama gik ma geng’o ng’ato bedo e kar ng’ato dwoko piny kendo weyo, kendo ng’ado ng’ato mar kinde medore kowuok e 0.005 ps nyaka 0.02 ps. Bang’ ng’ado bura, ogolo 6 μs ma nigi ng’wech mar 0.02 ps. Bang’ keto Emp24, ti gi yo maromre mar GUI mar CHARMM mondo iduok piny kendo iket sistemno e yo makare, kae to itiyo kuom s 8 e loso gikmoko.
Kuom sistem duto, e kinde ma itimoe gik moko e yo makare, ng’wechno rito gi gino ma ng’ato nyalo ng’eyogo gik moko (59), to e kinde ma itimoe gik moko, ng’ato nyalo rito gik moko e yo makare. E weche duto, presa ma ng’ato nigo en bar 1 kendo itiyo gi chenro mar ng’ado presa ma ng’ato nigo. E yor loso gikmoko kendo loso gikmoko, itiyo gi termostat (61) ma nigi nyalo mar dwoko ng’ato piny mapiyo mondo oket ng’ich mar protin, lipid kod gik ma ng’ato nyalo ng’adogo ng’ato. E kinde duto ma itiyogo, ng’ato onego obed gi 310K. <2Zepa> 10:10, 11. 10 Gik ma ok tudruokgo ikwan kuom loso list mar tudruok ka itiyo gi chenro mar Verlet ma nigi 0.005 mar ng’ado bura. <2Zepa> Wach mar Coulomb ikwan ka itiyo gi ng’wech mar dwoko kod bor mar ng’ado mar 1.1 nm. <2Zepa> Wach mar Vander Waals tiyo kod chenro mar ng’ado ma nigi bor mar ng’ado ma romo 1.1 nm, to chenro mar ng’ado ma Verlet tiyo kod ng’ado ma nyalo bedo ni nitie (62).
Ka itiyo gi VMD, bor mar yamo ma ng’ato nyalo ng’ado e kind ng’injo mag DOPC kata ng’injo mag AM1 kod protin en 0.7 nm, kendo ikwan kwan mar lipid ma tudruok gi protinno. Kaluwore gi fomula maluwogi, kwa kwan mar gik ma kelo ng’injo (DE) kaka ondik e (63): Kido mar DE = (kwan mar gik ma kelo ng’injo duto e ringruok 0.7) e kwan mar gik ma kelo ng’injo duto ma ni e ringruok 0.7 (kwan mar Cer ma ni e ringruok duto)
Nengo ma ondiki e ripot yudore kaka kwan mar ng’ato ka ng’ato, kendo bar mag ketho gin kopi ang’wen ma ok ochung’ kar ng’ato mag SE. Oboke mar kwan mar DE kwan gi t tes [(kwan mar DE-1) / SE]. Kwan nengo mar P kowuok e ng’injo ma nigi ng’injo achiel.
Ne otiyo gi gige GROMACS mondo ogol map mar 2D mar ng’injo mar ng’injo mar sistem ma nigi Emp24 e kind ns 250 mogik mag ng’injo. Mondo oyud map mar ng’eny mar ceramide, map mar ng’eny mar Cer ipogo gi kwan mar map mar Cer kod DOPC, kae to ipogo gi kwan mar Cer ma ni e ringruok. Ne itiyo gi rang’iny mar map mar rangi maromre.
Mondo iyud gik ma medore mag ndiko maeni, yie mondo iyud gik ma medore e wi ndiko ni.
Mae en ndiko ma ji duto nyalo yudo ma ipogo e bwo chike mag Ratiro mar Oganda ma Oken mar Ohala, ma oyiene tiyogo, keto kendo loso e yo moro amora, mak mana ka tiyo kode mogik ok en mar yudo ber mar ohala kendo ma ng’ato nyalo ng’eyo ni tich ma ne ondik mokuongo en adier. Rango.
Par niya: Wakwayi mana ni imi adres mari mar e-mail mondo ng’at ma ioro e mbui ong’e ni idwaro ni one e-mailno kendo ni ok en e-mail ma ok owinjore. Ok wabi kawo adres moro amora mar e-mail.
Penjo ni itiyogo mar temo ka in jalendo kendo geng’o oro spam ma ok owinjore.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D ma nigi ler ma malo mar picha ma nenore e kinde ma adier nyiso ber mar bor mar ng’injo mar ceramide e ng’ado protin e kuonde ma oyiergo gik ma owuok.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D ma nigi ler ma malo mar picha ma nenore e kinde ma adier nyiso ber mar bor mar ng’injo mar ceramide e ng’ado protin e kuonde ma oyiergo gik ma owuok.
©2020 Riwruok mar Amerka mar Dongruok mar Sayans. ratiro duto oriti. AAAS en jahera mar Hinari, Agora, Oare, Chorus, Clocks, CrossRef kod counter. 2375-2548, Dhi nyime mar Sayans.