<2Zepa> Kawuono *Adres ma sani: Kolon 50931, Jamani, Kolon Klasta mar Ng’eyo maber kaka ng’ato nyalo dwoko e wi kaka ng’ato nyalo bedo gi parruok e wi tuoche ma luwore gi bedo moti (CECAD).
Okang’ ma ng’ato nyalo ng’adogo bura kuom tuoche mag mitokondria, okawe ni ok nyal lokre nikech plastik mar ng’ato ma ng’ato nyalo ng’adoe bura en gima tin, kata kamano, ng’ato ok ong’ere maber kaka ng’ato nyalo ng’ado bura e wi ng’ato ma nyalo ng’ado bura e wi ng’ato. Kae, wakelo ng’injo mar ng’injo mag Purkinje ma nigi ng’injo mar OXPHOS ma dhi nyime ma kelo gik ma kethore e ng’injo mag ng’injo mag ng’injo mag Purkinje. Ne wayudo ni bedo ni mitokondria ok tiyo maber ne okelo lokruok maduong’ ahinya e weche mag ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo, ma bang’e ne omiyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo ng’ato ochako tiyo e yo ma luwore kapok selo otho. Ka ok wageno, ne wafwenyo ni nitie gik ma nenore maler ma nyalo miyo ng’ato obed gi ng’ol (PCx) kod gik mamoko ma geng’o ng’ato bedo moti ma medo gik ma ni e kind ng’ato gi ng’ato. Ka ng’ato ogeng’o PCx, mano ne omiyo ng’ato bedo gi parruok mang’eny kendo ne omiyo ng’ato bedo gi ng’ol e del, ma nyiso ni tuo mar ng’ut ng’ato nigi teko mar rito ng’ato e del ma onge OXPHOS. Ka ng’ato odwoko tudruok mar mitokondria e ng’ut ma osekethore ahinya, mano loko chuth kido mag ng’injo ma kamago, kendo mano geng’o tho mar selo. Gik ma waseyudo nyiso yore ma ne pok ong’ere chon ma miyo ng’ato bedo gi teko mar geng’o ng’ato mondo kik otiyo maber kendo nyiso ni nyalo mar ng’ato bedo gi nyalo mar ng’ado bura kata e kinde ma tuo osechopo e giko.
Tich maduong’ ma mitokondria timo e rito teko mar ng’ut ng’ato, inyiso gi ranyisi madongo mag ng’ut ma tudruok gi tuoche mag mitokondria mag dhano. Moko kuom tuochegi ikelo gi lokruok ma timore e jin ma rito kaka jin mag ng’ato nyisore (1, 2) kata ketho mar jin ma tudruok gi ng’injo mar ng’ato, ma ketho e yo ma ok owinjore ng’injo mar DNA mar ng’injo (mtDNA) (3, 4). Tich ma ne otim e ranyisi mag le osenyiso ni e dwoko mar ng’ato ma ok tiyo maber e tishu ma ni e alworane, yore mag ng’ado ringruok ma rito gik moko (5-7) nyalo tiyo, ma miyowa weche madongo mag ng’eyo matut kaka tuoche mapekgi kelo. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, ng’eyo marwa kuom lokruok ma timore e ringruok e kind kit sel moko ma kelo ketho ma ng’ato nyalo timo e obwongo en gima duong’ ahinya (8), kendo mano nyiso ni dwarore ni ng’ato ong’e gik ma nyalo konyo e thieth ma inyalo tiyogo mar geng’o kata geng’o tuoche. Ogeng’o tuoche mag ng’ut (9). Oganda mang’eny neno ni sel mag nerve nigi nyalo matin ahinya mar loko gik moko ka iporo gi kit sel mag tishu ma orumogi (10). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo ni sel ma kamago nigi tich maduong’ ahinya e loso gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre ng’ato mondo oket ng’ato e del kendo odwoko e kinde ma ng’ato oyudo hinyruok kod tuoche, nyalo mar loko gik ma ng’ato nyalo ng’ado e del mondo owinjore gi gik ma nyalo kelo pek e ng’ut ng’ato, chiegni ni en mana sel mag glial (11-14). Kaachiel gi mago, bedo ni sel mopogore opogore mag tishu mag obwongo geng’o ahinya somo mar lokruok ma timore e ringruok ma timore e grup matindo mag obwongo. Kaluwore gi mano, ok ong’ere ahinya kuom gik ma adier ma nyalo timore e sel kod gik ma nyalo timore e ringruok ka ng’ato ok tiyo maber e del.
Mondo wabed gi ng’eyo matut kuom gik ma nyalo timore ka ng’ato ok tiyo maber, ne wapogo ng’injo mag Purkinje (PNs) e step mopogore opogore mag ng’injo ma kelo ketho mar ng’injo ma oko mar ng’injo (Mfn2). Kata obedo ni Mfn2 ma ng’ato nyalo ng’ado e dhano nigi tudruok gi kit tuwo mar ng’ato ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato ma ong’ere kaka ng’at ma ng’ado bura, ketho mar Mfn2 e winyo en ng’at ma ong’ere maber ni nyalo miyo ng’ato kik ti maber. 16-19) kod gik ma wuok kuom gik ma kelo ng’ol mag ng’ut, luwore gi ranyisi mag ng’ut ma dhi nyime, kaka tuwo mag ng’ut (18, 19) kata ataxia mar ng’ut (16). Ka watiyo gi yore ma ng’ato nyalo ng’eyogo gik ma ng’ato nyalo ng’eyogo (LFQ), yore mag ng’iyo gik moko, ng’iyo gik moko, kod yore mag ng’iyo gik ma kelo tuoche, wanyiso ni ng’ato nyalo ng’iyo gik moko ma nyalo ketho del ma ng’ato nyalo ng’iyogo. Mondo wabed gi adier kuom tudruok mar gik ma ne wayudo, ne wadwoko piny ng’eyo ma PCx nigo e PNs ma onge Mfn2, kendo ne wayudo ni tichno ne medo pek mag oksidatif kendo ne omiyo ng’ato bedo gi nyalo mar ng’iyo gik moko mapiyo, ma omiyo ne wanyiso ni azoospermia miyo sel tho. Kaka MFN2 nyisore ahinya, mano nyalo reso chuth PN ma ng’ato othoe ka en gi ng’ol maduong’ mar OXPHOS, tiyo gi DNA mang’eny, kendo nenore ni ng’ato okethore, ma medo nyiso ni yo ma kamano mar tho mar ng’ato nyalo kata dwoko piny e rang’iny mar tuo mar selo.
Mondo wabed gi paro ma ok kare kuom mitokondria ma ni e PNs ma Mfn2 ogolo, ne watiyo gi kit ng’injo ma miyo mitokondria ma luwo Cre nyalo ng’ado bura kuom ng’injo mar Cre kendo ne wanono kaka mitokondria chalo e ringruok. Ne wayudo ni ketho mar Mfn2 e PNs ne dhi miyo ng’ato obed gi ng’ol mogik (Fweny S1A), kendo lokruok mokwongo ne oyudre ka en gi juma 3. Ka ipimo gi mano, ng’injo maduong’ mar ng’injo mar PN, kaka onyisre kuom ketho mar ng’injo mar Calbindin, ne ok ochako nyaka ka ng’ato nigi juma 12 (Fweny 1, A kod B). Kaka kinde ma ne ok chalre e kind lokruok mokwongo e kit ng’ato kod chakruok ma ne nenore mar tho mar ng’ato, nomiyo watimo nonro kuom lokruok ma ne timore e ng’ato nikech ng’ato ok tiyo maber kapok sel otho. 1C), kendo e mice ma ne ochung’ne (Mfn2 + / loxP:: mtYFP) ma bang’e iluongo ni CT1BRL (Fweny). 1B) kata gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato. Mondo wabed gi adier kuom ng’at ma oketi, ne watimo nonro mar LFQ kae to ne watimo nonro mar gik madongo, kendo ne wayudo ni nitie pogruok maler e kind ng’injo mag YFPhigh kod YFPneg (Fweny S1C). 21, 22), to onge ng’eny mar protin ma pile inyiso e ng’ut ng’ato kata e ng’ut ng’ato mamoko (Fweny 1D) ). Ka ipimo e kind sampuli e sel mag YFPhigh ma ne oketi e kidienje ma ne ochoki e temo ma ne otim gi ng’ato ka ng’ato, ne onyiso ni nitie tudruok maber> 0.9, ma nyiso ni nyalo maber mar nyuolo e kind gik ma ngima (Fweny S1E). E yo machuok, wechegi ne omiyo chenro marwa mar keto PN manyalo bedo mabor kendo maler en adier. Kaka sistem mar riembo ma L7-cre ma itiyogo miyo ng’ato bedo gi ng’iyo kendo e juma mokwongo bang’ nyuol (23), ne wachako ng’ado ng’wech mar ng’ado ng’wech kuom CTRL kendo ng’ado ng’wech mar ng’ado ng’wech. Bang’ ka osetieko loso gik moko kendo, iluongo ni Mfn2cKO ka en gi juma 4. Kaka giko, ne wayiero juma 8 mag higni ma ne PN ng’injo kata obedo ni ne nenore maler ni ng’injo mar mitokondria (Fweny 1B kod Fweny S1A). 3013, ma 22% kuomgi ne ochung’ne ndiko mag MitoCarta 2.0 ma luwore gi ng’injo mag ng’injo kaka ng’injo mag ng’injo (Fweny 1E) (Fweny 1E) (24). 10.5% kende mar protin duto ne nigi lokruok madongo (Fweny 1F kod Fweny S1F), ma protin 195 ne oketi piny to protin 120 ne oketi malo (Fweny 1F). En gima ber ng’eyo ni “ng’iyo yore manyien” mag kwan mar data maeni nyiso ni genes ma inyiso e yo mopogore opogore gin mag kwan mar yore mopogore opogore mag ng’ado gik moko (Fweny 1G). Gima ber en ni, kata obedo ni dwoko piny yore ma tudruok gi OXPHOS kod ranyisi mag calcium nyiso ni ng’ato ok nyal tiyo maber e PNs ma onge fusion, kidienje mamoko ma ng’enyne oriwo ng’injo mar amino asid ng’injo ahinya, ma luwore gi ng’injo ma timore e PN. bedo ma ok ti maber.
(A) Pichni ma nyiso kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik moko ma nyiso ni PNs (kalbindin, rangi mar rangi ma ng’we ng’ar) medore; nuklia ne oketi gi DAPI. (B) Kwan mar (A) (ng’iyo mar yo achiel mar pogruok, *** P <0.001; n = 4 nyaka 6 ng’injo kowuok kuom oyieyo adek). (C) Yor tich mar timo tem. (D) Map mar liet ma nyiso gik ma ng’ato nyalo ng’eyogo (ma malo) kod kit sel mamoko (e diere). (E) Ranyisi mar Venn ma nyiso kwan mar protin ma ng’ato nyalo yudo e PN ma oket e kidieny. (F) Plot mar got ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik ma opogore opogore e ng’injo mag Mfn2cKO e juma 8 (nengo mar ng’injo mar 1.3). (G) Ranyisi mar yore mag loso gik manyien nyiso yore abich madongo ahinya mag loso gik manyien (makwar) kod yore mag loso piny (makwar) e Mfn2cKO PN ma oket kaka juma 8. Onyiso rang’iny mar ng’ato ka ng’ato ma yudore kuom protin moro ka moro. Map mar liet mar rang’iny mar gray: nengo mar P ma oloki. ns, ok en gima duong’.
Gik ma ne oyudore e weche mag protin ne nyiso ni protin ma ne ni e kor lwasi mar I, III, kod IV ne dok piny mos e kinde. Kompleks I, III, kod IV duto ne nigi gik madongo ma ne ondiki gi mtDNA, to kompleks II, ma ne ondiki mana kod nuklia, ne ok okethore ahinya (Fweny 2A kod Fweny S2A). . Kaluwore gi duoko mag proteomics, nonro mar ng’injo mag ng’injo mag ng’injo ne nyiso ni MTCO1 (ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar IV e PN ne dok piny mos e piny (Fweny 2B). Mtatp8 ma ne oting’o mtDNA ne odok piny ahinya (Fweny S2A), to rang’iny mar ng’at ma ne ochung’ motegno ne ok olokore, ma en gima luwore gi ng’at ma ong’ere ni ATP ma ne oting’o ng’at ma ne ochung’ motegno ne odong’ ma ok olokore. Formasion en gima luwore. Ketho wach (7). 10:10, 11. 10 Ka ng’ato otimo nonro kuom kwan mar mtDNA ma ne ochung’ne ng’ato ka ng’ato, ne onyiso ni kwan mar kopi mag mtDNA ne dok piny mos e kinde. Ka opim gi grup ma ne ochung’ne, ka ne en gi juma 8, ne odong’ mana 20% mar mtDNA (Fweny 2C). Kaluwore gi duoko ma kamago, ne otiyo gi ranyisi mar Mfn2cKO PNs mondo ong’e DNA, ma nyiso kaka gik ma ng’ato nyalo tiyogo luwore gi kinde (Fweny 2D). Ne wayudo ni mana jogo ma ne odonjore e ketho protin mag mitokondria kod dwoko mar pek ma ne ochung’ne ng’ato, moriwo nyaka Lonp1, Afg3l2 kod Clpx, kod gik ma nyalo miyo ng’ato obed gi paro mapek. Onge lokruok maduong’ ma ne oyudre e kwan mar protin ma ne odonjore e tho (Fweny S2B). Kaka kamano, ne wayudo ni ng’injo mag mitokondria kod ng’injo mag ng’injo mag ng’injo ma ng’ato nyalo ng’iewogo gik moko nigi lokruok matindo kende (Fweny S2C). Kaachiel gi mago, ng’iyo mar protin ma tudruok gi ng’ato ok yudo lokruok maduong’, ma luwore gi ng’ado ma nenore mar ng’ado ng’ato ma ne oneno e ringruok kokalo kuom ng’iyo gik ma nyalo ketho ringruok kod ng’iyo gik ma nyalo ketho ringruok (Fweny S3). Kata kamano, ng’eny mar OXPHOS ma ok tiyo maber e PNs dhi kanyakla gi lokruok ma nenore maler ma timore e del. <2Zepa> Oganda mag mitokondria nyalo nenore e ringre mag sel kod yien mag dendrit mag Mfn2cKO PNs ma nigi higni 5 kod 8, kendo loso mar ng’ut ma iye osebedo gi lokruok maduong’ (Fweny S4, A kod B). Kaluwore gi lokruok ma kamago kod dwoko piny maduong’ e mtDNA, nonro ma ne otim kuom ng’injo mag ng’injo ma nigi ng’injo ma ng’injo (TMRM) nonyiso ni nyalo mar ng’injo ma ng’injo e Mfn2cKO PNs ne odok piny ahinya (Fweny S4C).
(A) Tiyo gi kinde mar ng’iyo rang’iny mar nyiso mar OXPHOS. <2Zepa> 10.05 e juma 8 (ANOVA mar yore ariyo). Laini ma nigi dots: Onge lokruok ma itimo ka iporo gi CTRL. (B) E korka achich: Ranyisi mar ng’et ng’ut ma nigi gik ma geng’o MTCO1 (bar mar skel, 20 μm). Kama ringre sel mag Purkinje odakgo oumo gi rangi ma ratong’. Owinjore: Kwan mar MTCO1 (ng’iyo mar yo achiel mar ng’iyo gik ma opogore opogore; n = 7 nyaka 20 mag sel ma ne otim nonro kowuok kuom oyieyo adek). (C) qPCR ng’iyo namba mar kopi mar mtDNA e PN ma ochung’ne (ng’iyo mar yo achiel mar pogruok; n = 3 nyaka 7 ng’iyo). (D) E korka achich: Ranyisi mar ng’injo mar ng’injo ma nigi gik ma geng’o DNA (bar mar ng’injo, 20 μm). Kama ringre sel mag Purkinje odakgo oumo gi rangi ma ratong’. Owinjore: Kwan mar mtDNA ma osekethore (ng’iyo gik ma opogore opogore e yo achiel; n = 5 nyaka 9 mag sel ma wuok kuom oyieyo adek). (E) Ranyisi mar ng’injo mar ng’injo ma nyiso ng’injo mag mitoYFP + Purkinje (asere) e rekod mar ng’injo mar ng’injo duto. (F) Kwan mar IV ma ng’ato nyalo ng’ado. (G) Rekod ma nyiso kaka ng’ato nyalo keto ng’ato e sel mag CTRL kod Mfn2cKO. Oboke ma malo: Pulse mokwongo ma ne okelo AP. Oboke ma piny: Frekwensi mar AP ma malo. (H) Kwan mar gik ma ng’ato yudo bang’ ng’iyo gik moko (sPSPs). Oboke mar rekod ma ochung’ne kod kwan mar zoom mare onyisre e (I). Ong’iyo ma yo achiel mar ng’iyo gik ma opogore opogore notimo nonro kuom n = 5 nyaka 20 mag sel ma wuok kuom oyieyo adek. Data inyiso kaka kwan ± SEM; * p <0.05; ** p <0.01; Pi <0.001 (J) Ranyisi ma nyiso AP ma otimore owuon ma ondiki ka oti kod yo mar keto gik ma oting’o ng’injo. Oboke ma malo: Frekwensi mar AP ma malo. Oboke ma piny: zoom mar AP achiel. (K) Kwan kwan mar AP ma ng’ato ka ng’ato nyalo ng’eyo kaluwore gi (J). Tem mar Mann-Whitney; n = 5 sel ma ne otim nonro kuom winyo ang’wen. Data inyiso kaka kwan ± SEM; ok en gima duong’.
Ne oyudre ni ng’at ma nigi juma 8 ma ne nigi ng’ol mar OXPHOS ne okethore, ma nyiso ni tije mag ringruok mag ng’ato ok ng’iyo ahinya. Omiyo, ne wanono kido mag stima ma ok ti mag ng’ato ma nigi ng’injo mar OXPHOS e juma 4 nyaka 5 kod juma 7 nyaka 8 kuom timo rekod mag ng’injo mag ng’injo mag ng’injo mag ng’injo mag ng’injo ma ng’injo (Fweny 2E). Ka ok ogeno, nyalo mar ng’ato ma ng’ato nyalo yueyoe kod nyalo ma ng’ato nigo mar ng’ado bura ne chal gi ng’at ma ne ochung’ne ng’ato, kata obedo ni ne nitie pogruok matindo e kind sel (Tebol 1). Kaka kamano, e juma 4 nyaka 5, ne ok oyudre lokruok maduong’ e winjruok ma nitie e kind ng’ato gi ng’ato (IV curve) (Fweny 2F). Kata kamano, onge ng’at ma nigi ng’injo mar Mfn2cKO ma ne nigi juma 7 nyaka 8 ma ne ochung’ motegno e kinde ma ne omiye IV (ng’injo mar ng’injo), ma nyiso ni nitie ng’injo maler ma nyalo miyo ng’ato obed gi nyalo mar ng’injo e kinde ma sani. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, e ng’injo mag Mfn2cKO, ng’injo ma kelo ng’injo ma kelo nyalo mar timo gik moko kendo (AP) nyalo rwako maber, ma nyiso ni ng’injo maggi duto ok opogore ahinya gi ng’injo mag ng’injo ma osebedo ka ng’injo kuom juma 8 (Table 1 kod Ranyisi 2G). Kaka kamano, kwan kod ng’eny mar gik ma ne timore bang’ ng’ato ng’ado bura (sPSCs) ne nyalo pimore gi mag grup ma ne ochung’ne, kendo kwan mar gik ma ne timore ne omedore kowuok e juma 4 nyaka juma 5 nyaka juma 7 nyaka juma 8 gi medruok ma kamano (Fweny 2, H kod I). <2Zepa> Kinde mar dongo mar sinaptik e PNs (25). Ne oyudo duoko machal bang’ keto PNs ma ne opong’ gi lum. Oganda ma kamago geng’o nyalo mar chulo gik ma ok odhi kare mag ATP e sel, kaka nyalo timore e rekod mar klamp mar sel duto. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, nyalo mar ng’ato mar yweyo kod ng’ato ka ng’ato ma nyalo ng’ado ng’ato gi ng’ato owuon ne ok okethore (Fweny 2, J kod K). E yo machuok, duoko ma kamago nyiso ni PNs ma nigi ng’ol ma nenore maler mar OXPHOS nyalo ng’ado bura maber gi ranyisi mag ng’ado mtoka ma nigi frekwensi mamalo, ma nyiso ni nitie yo mar chulo ma miyo ginyalo rito dwoko ma chiegni gi ma pile.
<2Zepa> Data inyiso kaka ± SEM (ng’iyo mar yo achiel mar pogruok, temo mar pimo mathoth mar Holm-Sidak; * P <0.05). Namba mar unit inyiso gi braket.
1G) oriwo yore ma nyalo geng’o ng’ol maduong’ mar OXPHOS, ma miyo walero gimomiyo PN ma oyudo hinyruok nyalo rito ng’ol ma chiegni gi kaka pile (Fweny 2, E nyaka K). . 3A kod S5A), kendo gik ma ng’ato yudo e giko nyalo medo ng’injo mar ng’injo mar ng’injo. Ne wayudo ni kwan mar BCAA (BCAT1) kod BCAT2 duto ne omedore. Gimedo ng’ado ng’wech mokwongo mar BCAA kuom loso ng’wech ma wuok kuom α-ketoglutarate (26). Gik moko duto ma loso ng’injo mar ng’injo mar keto asid mar ng’injo (BCKD) ochung’ne ng’injo (ng’injono kelo ng’injo ma luwo bang’e kendo ma ok nyal lokre mar ng’injo mar BCAA ma wuok kuom ng’injo) (Fweny 3A kod Fweny S5A). Kata kamano, onge lokruok ma nenore maler e BCAA owuon ma ne oyudre e PN ma ne oket, ma nyalo bedo ni ne otimore nikech medo ng’ado mar amino asidi madongogi kata tiyo kod gik mamoko (glukosis kata asid laktik) mondo omed ng’ado ng’wech mar TCA (Fweny S5B). PNs ma onge OXPHOS bende ne nyiso ni ng’ato medo ng’ado ng’ute kendo ng’ado ng’ute e juma 8, ma nyalo nyisore kuom ng’ado ng’ute ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato (GLS) kod ng’ato ma ng’ato nyalo ng’ado ng’ute (GPT2) (Fweny 3, A kod C). En gima ber ng’eyo ni ng’ado bura mar GLS ochung’ mana kuom ng’ado bura mar ng’ado bura (lokruok mar Mfn2cKO/CTRL en mana nyadi 4.5, P = 0.05), kendo ng’ado bura mare makende e tishu mag kansa nyalo konyo ng’ado bura mar kansa. (27).
(A) Map mar liet nyiso lokruok ma timore e rang’iny mar protin e yo ma oket bang’ juma 8. (B) Ranyisi mar ng’injo mar ng’injo ma nigi gik ma geng’o PCx (bar mar ng’injo, 20 μm). Oboke ma ratong’ nyiso ringre sel mar Purkinje. (C) Ranyisi mar ng’iyo gik ma ng’ato timo e kinde ma ng’ato nyalo ng’eyo ni en ng’at ma dwarore ahinya mondo oyud tuwo mar ng’ol (test mar t mang’eny, * FDR <5%; n = 3-5 mice). (D) E wi: Picha mar ranyisi ma nyiso yore mopogore opogore mag donjo e karbon ma ondikie nying’ ma ni e [1-13C] ma ng’ato nyalo ng’adogo bura (ma en, kokalo kuom PDH kata yo ma ng’ato nyalo ng’adogo ng’ato). 13C]pyruvate (t-test mar ariyo; ** P <0.01). (E) Nonro matut mar historia mar kinde mar yo ma onyis. <2Zepa> Par mana protin ma nigi P <0.05 e juma 8. Laini ma ondiki gi ranyisi: onge nengo mar lokruok (ng’iyo mar yore ariyo mag pogruok; * P <0.05; *** P <0.001). Data inyiso kaka kwan mar ± SEM.
E nonro marwa, BCAA osebedo achiel kuom yore madongo mag dwoko piny. <2Zepa> Adiera ma kamano nyiso ahinya ni ng’injo mar yamo ma donjo e siklo mar TCA nyalo lokore e PN ma onge OXPHOS. Mano nyalo nyiso yo maduong’ mar dwoko ng’ato piny, ma nyalo bedo gi teko maler kuom ng’ato kod ngima mar ng’ato e kinde ma rito ng’ato ma ok tiyo maber ahinya mar OXPHOS. Kaluwore gi paro ma kamano, ne wayudo ni enzyme maduong’ ma geng’o ng’ol mar remo PCx ochung’ malo (Mfn2cKO/CTRL lokore maromo nyadi 1.5; 30). Kaluwore gi duoko mag ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’eyo, ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo ne nyiso ni PCx ne omedore ahinya kendo ne omedore ahinya e PNs ma ne onge OXPHOS, to PCx ne omedore ahinya e sel ma ne ni machiegni gi glial mag Bergmann ma ne ochung’ne (Fweny 3B). 13C] 1-13C] 1-13C] 1-13C. Ka ne piruvate otiyo gi oksijen mar piruvate (PDH), ranyisi mare mar isotope ne olalo , To ne odonjore e gik ma ng’ato nyalo ng’ado e kind ng’wech mar TCA ka piruvate olokore kokalo kuom gik ma ng’ato timo e ringre (Fweny 3D). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nyalo ng’eyo ni en ng’at ma ng’iyo gik ma ng’ato timo, ne aneno ni kwan maduong’ mar gik ma nyiso ni ng’ato nigi ng’eyo ma ng’ato nyalo ng’eyogo ng’ato, to asidi mar ng’ato kod ng’ato bende ne nigi ng’iyo ma ng’ato nyalo ng’iyogo, kata obedo ni ok en gima duong’ (Fweny 3D).
In the dopamine neurons of MitoPark mice with mitochondrial dysfunction caused by dopamine neurons specifically destroying the mitochondrial transcription factor A gene (Tfam) (Figure S6B), PCx expression was also significantly up-regulated (31), indicating that acetone acid arteriosclerosis The occurrence of the disease is regulated during the dysfunction of neuronal OKSFOS ma ni e ringruok. 32-34) ma nyalo nyisore e ng’ut ma nyalo bedo ni nitie tudruok gi ng’ol mar ng’ut, ng’eny ahinya e PN ma onge OXPHOS, kaka ng’ut ng’ato ma nyalo ng’ado ng’ut ng’ato. (ME3), ma tije maduong’ en dwoko piruvate kuom malate (Fweny 3, A kod C) (33, 35). Kaachiel gi mago, ne wayudo medruok maduong’ e ng’injo mar Pdk3, ma miyo PDH bedo ma ok ti (36), to onge lokruok ma ne oyudre e ng’injo mar Pdp1 ma miyo PDH tiyo kata e ng’injo mar PDH owuon (Fweny 3A). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nyalo bedo gi ng’eyo matut kuom ng’ato ka ng’ato (PDHE1α) mar ng’ato ka ng’ato ma nigi ng’injo mar PDH (ma ong’ere ni ogeng’o tije mag enzyme mag PDH) ne omedore ( Ranyisi S6C ) ( Ranyisi S6C ). Piruvet onge gi yo mar donjo e remo.
1G kod S5C) duto gin gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wigi, kaluwore gi ripot, e kinde ma ng’ato timo gik moko. Tishu ma ochung’ne ng’ato ng’ado bura ka ng’ato ok tiyo maber (5-7). 10:10, 11. 10 Kaka ng’ato nyalo ng’eyo ni, e PN ma ne onge OXPHOS, ne oket ng’injo mag ng’injo mag ng’injo ma ne nigi juma 8 e bwo ng’injo mar ng’injo mar 2 (SHMT2), ma en enzyme maduong’ e ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo. Dwoko maduong’ mar teko mar ringruok (Fweny S5D). 13:10, 13. 13 E 13:10, 13. 13 E 13:10, 13. 13 E 13:10, 13. 13 E 13:10, 13. 13 E 13:10, 13. 13 E CU-glukosis ma ne oketgi e ng’ut ng’ato, temo mag ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo ne omedo nyiso ni ng’ato nyalo ng’ado bura maber e wi ng’ato, ma nyiso ni ng’ato nyalo ng’ado bura e wi gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato (Fweny S5E). Kaka gik ma GLS kod GPT2 kelo gin gik ma kelo loso mar glutamate kowuok e glutamine kod loso e kind glutamate kod α-ketoglutarate, losogi ma malo nyiso ni ng’injo ma nigi OXPHOS nigi dwaro ma medore mar glutamate . Ka ipimo gi lokruok ma kamago, nonro ma ne otim kuom ng’injo mag ng’injo mag ng’injo mag Mfn2cKO ma nigi PN, nonyiso ni yorego (moriwo nyaka gik moko duto ma geng’o ng’injo) ne ok olokore ahinya e nyiso, ma omiyo onyiso ni ng’injo mar ng’injo mar ng’injo en ng’injo mar PN ma okethore (Fweny S6, G).
E yo machuok, nonro ma kamago nofwenyo ni nitie yore mopogore opogore mag tiyo gi yore mopogore opogore mag ng’ado ringruok e PNs. Kata obedo ni tich ma ok owinjore mar ng’ut ng’ato nyalo miyo ng’ato obed gi tuwo mar ng’ol mapiyo kendo loso 1C (Fweny 3E kod Fweny S5C), kendo kata lokruok ma nyalo bedoe e ranyisi mar I kod IV, lokruok ma timore e loso mar serine de novo gin mana. OXPHOS ok tiyo maber (Fweny 3E kod Fweny S5C). Gik ma ne oyudregi nyiso yo ma luwore ma ng’ato nyalo ng’eyogo kaka ng’ato nyalo bedo gi parruok mang’eny (1C sikl) kod sitoplasma (serin biosynthesis) dwoko e yo ma nyalo konyo e medo ng’ol mar ng’ut ng’ato e sikl mar TCA mondo olok kaka ng’ato timo gik moko e ringre ng’ato.
PNs ma nigi OXPHOS ma nigi juma 8 nyalo rito tich mar kelo mor ma nigi frekwensi mamalo kendo nyalo bedo gi tudruok maduong’ mar ng’ato mondo ochul ng’ato ma ok tiyo maber. Gima ne oyudreno kelo paro ma kelo mor ni kata e kindeni, sel ma kamago bende nyalo yudo thieth mar geng’o kata geng’o ng’ol mar ng’ut. Deko. Ne waloso nyalo ma kamano kokalo kuom yore ariyo ma ne ochung’ kar ng’ato ka ng’ato. E yo mokwongo, ne waloso ng’at ma nyalo kelo tuoche ma nyalo kelo tuoche ma nyalo kelo tuoche ma nyalo kelo tuoche (AAV) mondo MFN2 onyalo nyisore e yo ma owinjore e PNs ma onge OXPHOS e ringruok (Fweny S7A). AAV ma keto kod mar MFN2 kod mCherry (Mfn2-AAV) ma ne oting’o ler ma ne oting’o ler ne otimre e kit ng’ato ma ne ochung’ne ng’ato, ma ne omiyo MFN2 onyisre e yo ma ne ochung’ne Cre kendo ne oreso ng’ato ma ne ochung’ne ng’ato, ma omiyo ne ogeng’o ng’ato mondo kik olokre e ng’ato. Bang’e, ne watimo temo mag ringruok mondo water Mfn2-AAV ma nigi juma 8 e yo ma ok ng’iyore e ng’ut Mfn2cKO kod ng’injo ma ne ochung’ne, kendo ne wanono ng’injo ma ne nigi juma 12 (Fweny 4A). 16:10, 11. 16 Ne otho (Fweny 1, A kod B) (16). Virus ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre ng’ato ne omiyo PN ochung’ motegno e circle moko mag ng’ut (Fweny S7, G kod H). <2Zepa> Injekson mar AAV ma rito ma nyiso mana mCherry (Ctrl-AAV) ne onge gi teko maduong’ e wi ng’injo mar ng’injo e le mag Mfn2cKO. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nigi teko maduong’ mar rito ng’ato (Fweny 4, B kod C). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, ng’eny mar ng’ato neno ni ok nyal pogore gi le ma ne ochung’ne (Fweny 4, B kod C, kod Fweny S7, H kod I). 4C kod Ranyisi S7, C kod F), ma nyiso ni MFN1 ma ok ni e ot nyalo konyo e yoo makare kuom bedo maonge mar MFN2. 10:10, 11. 10 Kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik moko e rang’iny mar PN achiel, ne onyiso ni Mfn2-AAV ne oreso ahinya ng’injo mag mitokondria, ne oketo rang’iny mar mtDNA obed kaka pile, kendo ne oloko ng’injo ma malo mar PCx ​​(Fweny 4, C nyaka E ). Ka ne otim nonro gi wang’ kuom winyo ma Mfn2cKO ma ne ores e chal mar yweyo, ne oneno ni kaka ne gichung’ kod ranyisi mag ng’wech (wuotho ​​S1 nyaka S3) ne omedore. E giko, temo ma kamago nyiso ni dwoko MFN2 kendo e PNs ma nigi ng’ol maduong’ ahinya e OXPHOS oromo mondo olok mtDNA ma itiyogo kendo kelo ng’ol mar remo, ma miyo geng’o ng’ol mar axon kod tho mar ng’ol e ringruok.
(A) Skema ma nyiso chenro mar timo tem mar keto AAV ma keto kod MFN2 ka yo ma onyis mar ng’ado ringruok ochako tiyo. (B) Piche ma nyiso gik ma ng’ato nyalo ng’eyo e wi ng’ato ma nigi juma 12 ma ne olosi e juma 8 e winyo mag Mfn2cKO kendo ma ne ondikie gi gik ma geng’o ng’ato. E bath: Oting’o ng’injo mag axon. Okang’ ma ng’ato nyalo ng’eyogo en 450 kod 75 μm. (C) E korka achich: Kwan mar ng’eny mar sel mag Purkinje e ng’injo mar AAV (AAV +) (ng’iyo mar yo achiel mar pogruok; n = 3 oyieyo). (t-test ma ok oket; n = 6 sel ma wuok kuom oyieyo adek). * P <0.05; ** p <0.01. (D) Mikrograf mag elektron ma nyiso PNs mag ng’injo mag Mfn2cKO ma oting’o gik ma onyis mag ng’injo. Mask ma pink nyiso kama dendrites odak e iye, to square ma nigi dots ma ratong’ nyiso kaka zoom ma ochiw e bath lwet ma korachwich; n ochung’ ne nuklia. Bar mar pim, 1μm. (E) nyiso ranyisi mar PCx ​​ma ng’ato nyalo keto e PN ma ne olosi e juma mar 12. Bar mar pim, 20 μm. OE, nyiso gik moko mokalo kiewo; FC, loko lokruok.
Kae to, ne wanono ber mar ngima mar sel ma kelo peroksidase e PN ma osebedo ka yudo pek mag OXPHOS. Ne waloso mCherry ma ne keto kod AAV-shRNA (RNA machuok) ma ne ochung’ne mRNA mar PCx ​​mar oyieyo (AAV-shPCx), kendo ne waketo virusno kata ng’at ma ochung’ne (AAV-scr) e obwongo mar oyieyo ma Mfn2cKO. Ne otim injection e juma mar ang’wen mar higni (Fweny 5A) mondo oyud PCx ma tiyo maber e kinde ma PCx ne nyisore (Fweny 3C) kendo ma ne ng’injo mar PN ne pod ochung’ motegno (Fweny 1A). En gima ber ng’eyo ni goyo PCx piny (Fweny S8A) kelo ng’wech maduong’ mar tho mar PN, ma en mana ring’o ma nigi tuo (Fweny 5, B kod C). Mondo wabed gi ng’eyo matut kuom kaka PCx nyalo kelo gik ma nyalo ketho ringruok, ne wapuonjore chal mar redox mar PNs bang’ ka PCx osegoyo piny kendo ne okethore e kinde achiel. Kae to, ne watimo ranyisi ariyo mag ng’iyo gik ma ng’ato nyalo timo e ngimane duto (FLIM) e ng’injo mag obwongo ma ng’ato nyalo ng’iyogo ma nigi juma 7 kata ng’injo ma ng’ato nyalo ng’iyogo mondo wang’e lokruok ma nyalo timore e chal mar redox mar ng’ato bang’ ng’iyo gik ma ng’ato timo (Fweny S8, E nyaka G). 10:10, 11. 10 Ne onyiso ni ng’ato achiel ma nigi ng’ol ma nigi PCx ne omedore ahinya, ma opogore gi ng’at ma nigi PCx ma ne ochung’ne ng’ato kata ng’at ma ne ochung’ne mana shRNA ma ne okethore (Fweny 5, D kod E). Ka PCx ne oket piny, kwan mar PNs mag Mfn2cKO ma ne nyiso ni ne gin gi oksijen mang’eny ne omedore gi nyadidek (Fweny 5E), ma nyiso ni PCx ne oketo nyalo mar redox mar ng’injo ma ne okethore.
(A) Skema ma nyiso chenro mar timo tem mar keto AAV ma keto kod shPCx ka yo ma onyis mar ng’ado ringruok ochako tiyo. (B) Pichni ma nyiso kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik ma ng’ato timo e wi ng’ato ma nigi juma 8 e kind mice mag Mfn2cKO ma ne oloki kendo ondiki gi gik ma geng’o ng’ato e juma 4. Bar mar pim, 450 μm. (C) Kwan mar ng’eny mar sel mag Purkinje e lum ma AAV oloko (ng’iyo mar yo achiel mar pogruok; n = 3 nyaka 4 mice). Data inyiso kaka kwan ± SEM; Pi <0.001 (D) Picha mar FLIM ma nyiso kinde ma PN ma nigi juma 7 ma nyiso ng’eyo ma ng’ato nigo mar ng’ato nyalo dak e bwo gik ma ng’ato nyalo timo e temo. LUT (tebol mar neno) kwan: kinde ma ng’ato nyalo dakgo (e pikosekon). Bar mar pim, 25 μm. (E) Histogram nyiso kaka kwan mar ngima mar Grx1-roGFP2 opogore opogore kowuok e (D) (n = 158 nyaka 368 e sel ariyo e bwo ng’ato ka ng’ato). <2Zepa> Chat mar pie ma ni e wi histogram ka histogram: nyiso kwan mar sel ma nigi kwan mar ngima mabor ahinya (makwar, ma nigi oksijen) kata matin (makwar, ma odok piny), ma okadho 1 SD mar kwan mar ngima ma ng’ato ka ng’ato nyalo bedogo e CTRL-AAV-scr. (F) Model ma ne oket nyiso kaka PCx ma ng’ato nigo nyalo rito ng’ato.
Kaka duto, weche ma wachiwo kae nyiso ni dwoko mar MFN2 nyalo reso chuth PN ma osedhi nyime ma nigi ng’ol maduong’ mar OXPHOS, mtDNA ma ng’eny ahinya, kod ng’ol ma chal gi ista ma ok ng’iyore ahinya, ma miyo ng’ato bedo gi dongruok ma dhi nyime kata e tuoche ma osedhi nyime. Gik ma nyalo ketho ng’ato miyo ng’ato bedo gi neno monyalo lokore kuom kinde ma ne en-go kapok sel otho. Okang’ mar ng’iyo gik moko e ringruok medore bedo gi teko kuom nyalo ma ng’ut ng’ato nigo mar kelo ng’ol mar remo (ma ng’ato nyalo ng’iyogo ng’ol mar TCA), ma geng’o PCx nyisore e PNs ma onge OXPHOS kendo medo tho mar selo, ma omiyo gibedo gi tich mar rito (Fweny 5F).
E puonjruokni, ne wachiwo neno monyiso ni dwoko mar PNs kuom ketho mar OXPHOS en ng’ado ng’wech mos e ng’wech mar TCA kokalo kuom yo mar ng’ado ng’ut mopogore opogore ma ng’ato nyalo ng’ado gi program mag ng’ado ng’ut. Ne wajiwo ng’iyo mar proteom gi yore mang’eny ma konyo kendo ne wafwenyo ni ka ng’ato oyudo pek nikech ng’ol mapek mar mitokondria, ng’injo mag del nigi yo ma ne pok ong’ere chon mar ng’injo mar ng’injo. Kaka ng’ato nyalo bedo gi bwok, yo duto mar keto waya kendo ok nyis ga ni ng’ato nyalo bedo gi ng’ol ma dhi kanyakla gi ng’ol mos e yo ma ok nyal lokre, kata kamano, weche ma wan-go nyiso ni nyalo bedo ni en ng’at ma rito ng’ato kata e kinde ma pok sel otho. Gima oyudo nyiso ni neurons nigi nyalo maduong’ mar loko gik moko e ringruok. <2Zepa> Adiera ma kamano nyiso ni bang’e, keto MFN2 kendo nyalo loko kaka gik madongo ma nyiso ni ng’ato nyalo ng’iyo gik moko kendo geng’o ng’injo mar PN. Kata kamano, ogeng’o ng’ol mar remo kendo omiyo nerves bedo mapiyo. ng’ato ma ng’iyo gi chwo kata mon.
Achiel kuom gik ma ne wayudo ma ng’ato nyalo ng’iyogo ahinya e nonro marwa en ni PNs ma onge OXPHOS nyalo loko kaka TCA loso gik moko kuom loso gik ma nyalo miyo ng’ato obed gi ng’ol e del. 10:10, 11. 10 Kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik ma ng’ato timo, ma moko kuomgi geno kuom glutamine mondo omed gik ma ng’ato nyalo ng’ado e kindgi mondo okel gik ma dwoko piny ng’ato, ma riembo ng’ato mondo oyud gik ma nyalo dwoko piny ng’ato, ma riembo ng’ato mondo oyud gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo kendo rito loso gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo (39 , 40). <2Zepa> 5, 41), kama yo ma glutamin donjogo e siklo mar TCA luwore gi Nikech pek mar hinyruok mar OXPHOS (41). ). Kata kamano, onge gik ma nyiso maler ni nitie gik ma chalre e kind gik ma ng’ato nyalo timo e ringre ng’ato kod kaka nyalo bedo ni en gi tudruok e wi tuoche. E nonro moro ma osetim machiegni, ne onyiso ni ng’injo madongo mag kor ng’ato nyalo loso gik ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato mondo oter ng’ato, kendo mano miyo ng’ato bedo gi nyalo mar ng’ado bura e wi ng’ato (42). En gima ber ng’eyo ni e bwo geng’ruok mar thieth mar enzyme ma kelo ng’injo mar TCA, igeno ni ng’injo mar pyruvate nyalo rito loso mar oksaloasetat e ng’injo mag ng’injo mag ng’injo mag ng’injo mag ng’injo (34). Kata kamano, tudruok ma nitie e ringruok mar yoregi gi tishu mag obwongo (kama igeno ni tuo mar ng’ut ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato) pod nigi puonj maduong’ ahinya e ringruok (43). E yo ma kamano, weche ma wan-go nyiso ni PNs ma OXPHOS okethore e ringruok nyalo lokore obed ketho mar BCAA kod ketho mar pyruvate, ma gin yore ariyo madongo mag medo gik ma nyalo konyo e ng’ado ng’ato gi ng’ato. Kata obedo ni ng’ato nyalo ng’ado bura ni BCAA nyalo konyo e loso teko mar ng’ato, ka ok oting’o tich ma glutamate kod GABA timo e ng’ato (44), pod onge gik ma nyiso ni yorego tiyo e ringruok. Omiyo, en gima yot paro ni PNs ma ok ti maber nyalo chulo giwegi gik ma TCA ma ng’ato tiyogo ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato kuom medo ng’ol mar remo. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, PCx nyalo dwarore mondo orit dwaro ma medore mar asidi mar aspartik, ma iparo ni e dongo sel ma nigi ng’ol mar mitokondria (45). Kata kamano, nonro marwa mar ng’iyo gik moko ne ok ogolo lokruok moro amora maduong’ e rang’iny mar asidi ma ng’ato nyalo ng’ado e Mfn2cKO PNs (Fweny S6A), ma nyalo bedo ni nyiso kaka asidi mar ng’ato tiyo mopogore opogore e kind sel ma medore kod ng’ato ma bang’ ng’ado ng’ato. Kata obedo ni yo ma adier mar PCx ​​loso e ng’injo ma ok ti maber e vivo pod nyaka ng’ere, ne wanyiso ni dwoko ma ok odhi kare ni nigi tich maduong’ ahinya e rito chal mar redox mar ng’injo, ma ne onyis e temo mag FLIM e wi ng’injo mag obwongo. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, geng’o PNs mondo kik ochung’ ne PCx nyalo miyo obed gi oksijen mang’eny kendo miyo sel tho mapiyo. <2Zepa> 7:10, 11. 10 Kaka BCAA nyalo ketho piny kendo keto karboksilasion mar pyruvate ok gin yore mag nyiso kido mag tishu mag ng’ato ma ok tiyo maber (7). Omiyo, nenore ni gin gik ma ng’ato onego oket mokuongo e ng’ut ma onge OXPHOS, kata obedo ni ok gin gino kende, ma en gima duong’ ahinya e ng’ado ng’ut. .
<2Zepa> Tuwo mar ng’ut ng’ato en kit tuwo ma opogore opogore ma nyalo ketho ng’ut ng’ato ma thothne nyisore kaka ataxia kendo ma kinde mang’eny ketho PNs (46). 16, 47, 48, 16:16, 16. 16, 47, 48. Oganda ma ng’ato nyalo bedo gi ng’ol e wi ng’ato nikech ng’ato nyalo bedo gi ng’ol ma nyalo ketho ng’ato e winyo. Kaluwore gi ripot, ranyisi mar ng’at ma olosi gi ng’at ma nigi ng’at ma nyalo lokore, tudruok gi ataxia mar ng’ut dhano kendo en gi ng’ol mar ng’ut (49, 50), ma nyiso ber mar somo gik ma nyalo timore ka ng’ato onge gi OXPHOS e PNPH. Kuom mano, en gima owinjore ahinya mondo oket kendo opuonjre maber kwan mar neuron makendeni. Kata kamano, nikech PNs winjo maber ahinya ka giyudo pek kendo gin gik ma kelo kwan matindo mar sel duto mag obwongo, kuom nonro mang’eny ma ochung’ne omics, pogogi kaka sel duto pod en gima tek. Kata obedo ni ok nyalre ahinya chopo bedo maonge chuth mar kit sel mamoko (ahinya ahinya tishu mag jomadongo), ne waketo okang’ matiyo maber mar ng’ado ng’ato gi FACS mondo wayudi namba moromo mar ng’ato ma nyalo tiyo maber mar ng’iyo gik ma nyalo timore e del, kendo wan gi kwan maduong’ ahinya mar gik ma nyalo ketho ringruok (ma romo 3000) (51). Ka warito nyalo mar sel duto, yo ma wachiwo kae ok miwa thuolo mar ng’iyo mana lokruok ma timore e yore mag ng’ado gik moko e mitokondria, to bende wanyalo ng’iyo lokruok ma timore e sel ma ng’ato nyalo ng’adogo, ma konyo tiyo kod gik ma ng’ato nyalo ng’ado e ringre ng’ato mondo omed ng’ado namba mar sel. (52, 53). Yo ma walero ok owinjore mana gi somo mar sel mag Purkinje, to bende inyalo tiyogo mayot e kit sel moro amora mondo ilos lokruok ma timore e obwongo ma nigi tuoche, moriwo nyaka yore mamoko mag ng’ado bura ma ok tiyo maber.
E giko, wasefwenyo dirisa mar thieth e kinde ma ng’ato loso gik moko kendo ma nyalo loko chuth ranyisi madongo mag ng’ol ma ni e del kendo geng’o ng’ol mar del. Omiyo, ng’eyo kaka ng’ato nyalo timo gik ma nyalo miyo ng’ato obed gi ng’eyo matut kuom yore ma nyalo konyo e rito nyalo mar ng’ato e kinde ma ng’ato ok tiyo maber. Owinjore otim nonro e kinde mabiro ma nigi gino mar ng’eyo lokruok ma timore e kaka teko tiyo e kit sel mamoko mag obwongo mondo onyis chuth kaka chikni nyalo tiyo kuom tuoche mamoko mag obwongo.
<2Zepa> MitoPark osebedo ka olero chon (31). 18) kendo oseketgi e kindgi gi loxP ma luwo jin mag Mfn2. Bang’e, ne giyudo nyithindo ma ne nigi ng’injo ariyo ma ne opogore opogore gi ng’injo ariyo ma ne nigi ng’injo machalre mondo giyud gik ma ne nyalo ketho ng’injo ma ne gin mag Purkinje ma ne nyalo ketho ng’injo ma ne gin mag Mfn2 (L7-cre). E ng’wech matin mar tudruok, ne oketi allele mar Gt (ROSA26) ma ne ochung’ne ng’ato ka ng’ato kokalo kuom ng’ado bura ma medore (20). Gik moko duto ma ne itimo ne le ne otimre kaluwore gi chike mag piny Ulaya, mag pinyno, kod mag riwruoge kendo ne oyienegi gi chike mag piny Umwelt kod piny ma piny Jerman. Tich ma itimo gi le bende luwo yore ma Riwruok mar Sayans mar Le mag Laboratori ma ni e piny Ulaya ogolo.
Bang’ keto yath mar ng’ado ng’ut dhako ma nigi ich, igolo ng’ut ng’ato ma nigi ich (E13). mM Hepes kendo ne okalo e ng’ut ng’ato ma nigi papain (20 U/ml) kod ng’injo (1μg/ml). Iketo tishu e DMEM) kendo ipogogi kokalo kuom ng’ado chiemo. Ml) e 37°C kuom dakika 20, kae to itiyo gi masin e DMEM ma opong’ gi 10% mar remo mar nyathi ma pod ni e ich. 106 e dish mar 6 cm kata e ng’injo mar 0.5 × 105 sel/cm2 mondo otim nonro mar picha. Bang’ seche 4, ne oloko gik ma ne itiyogo gi gik ma ne itiyogo ma ne nigi 1% mar B27 kod 0.5 mM mar GlutaMax. Bang’e, ne iketo ng’injogo e 37°C kod 5% mar CO2 e kinde duto ma ne itimo nonro, kendo ne imiye chiemo dichiel e juma. Mondo oket ng’injo kendo e ng’injo, ne otiyo gi 3 μl (dish mar ng’injo ma nigi pi 24) kata 0.5 μl (dish mar ng’injo ma nigi pi 24) mar ng’injo maluwogi mag AAV9 mondo othiedh ng’injo e odiechieng’ mar ariyo e ng’injo. 105530-AAV9) kod namba mar katalog 105545-AAV9.
23212 kod 23213, kaka giluwore) ondiki gi ranyisi mar V5 (GKPIPNPLLGLDST) e giko mar C, kendo oketgi kanyachiel gi mCherry e frem kokalo kuom ranyisi mar T2A. Grx1-roGFP2 en mich mowuok kuom Heidelberg TP Dick DFKZ. Ka ne iloko kaset mar tdTomato ka itiyo gi yore ma pile pile mag loso gik moko, ne iketo kasetno e ng’ut pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (Addgene reference namba 28306) mondo okel pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-TdTomato. Vekta mag FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 kod pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Ne otiyo gi yo ma kamano mar loso gik ma nyalo rito gik moko. Mondo omi loso AAV-shPCx, dwarore ni oket plasmid AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- 3′) E bwo loch mar jalony mar U6, mCherry itiyogo e bwo loch mar jalony mar CMV. Ne oloso gik ma konyo e tero AAV kaluwore gi kaka jalony ne onyise (Cell Biolabs). E yo machiek, ti ​​kod plasmid mar tero ma oting'o mcherry-t2a-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) e yor ng'uono mar 290 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) kata Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-ROGFP2) ma keto kod mag jin, kaachiel gi keto kod mag protin mar AAV1 kod protin ma konyogi. Virus ma ok owang’ ma ne odong’ e wi ng’ato ne oyudre kuom ng’ado ng’ato e pi ma ng’ato nyalo ng’ado e iye ma otuo ma nigi baraf/ethanol kendo ne oketo sel ma ng’ato nyalo ng’ado e pi ma ng’ato nyalo ng’ado e iye (PBS). 10:10, 11. 10 Ne oting’o ng’injo ma ne ok odhi nyime gi ng’injo (seche 24 e 32,000 rpm kod 4 °C) kendo ne oketo ng’injo ka otiyo gi filta ma ng’injo ma ok dhi nyime. 2.9×1013 kopi mar genom (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), kwan mar adier mar AAV1-CAG-FLEX ne opim kaka chon (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) kod AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Ne oting’o ng’injo madongo e PBS ma ng’ich kaka baraf, ne oketgi e pellet, kae to ne oketgi e 0.5% mar triton X-100 / 0.5% mar sodium deoxycholate/PBS ma ne nigi gik ma geng’o ng’injo mag ng’injo (Roche). Ne otim nonro mar kwan mar protin kuom tiyo kod ranyisi mar asidi ma ng’ato nyalo ng’eyogo (Thermo Fisher Scientific). Bang’e, ne ipogo protingo ka itiyo gi yo ma ne itiyogo gi ng’injo mar SDS, kae to ne iketogi e wi ng’injo ma ne itiyogo e ng’injo (GE Healthcare). Ogeng’o kuonde ma ok ng’ere kendo oketgi gi gik ma geng’o tuoche madongo (neno Tebol S1 mondo iyud weche mathoth) e 5% mar chak e TBST (saline ma nigi tris ma nigi Tween), step mag lwoko kod gik ma geng’o tuoche madongo e TBST Ketogi. Oketo gi gik ma geng’o tuoche madongo kuom otieno achiel e +4°C. Bang’ lwoko, ng’ad gik ma geng’o tuo mar ariyo kuom seche 2 e ng’ich mar ot. Bang’e, kuom keto ng’injo maromreno e ng’injo ma geng’o β-actin, ne oyang ni ng’injo maromreno ne oting’o. Fwenyruok kuom loko obed ler mar kemikol kendo medo ler mar kemikol (GE Healthcare).
Ne oketgi e 4% mar paraformaldehyd (PFA)/PBS e kinde ma ne oketgi e ng’ich mar ot kuom dakika 10. 100/PBS kuom dakika 5 e ng’ich mar ot, kae to iketo e buffer ma geng’o [3% mar albumin mar ng’ombe (BSA)/PBS]. E odiechieng’ mar ariyo, ne iloso gik ma ne oumo gik moko gi buffer ma geng’o gik moko kendo ne iketogi e gik ma nyalo geng’o gik moko ma nyalo geng’o gik moko kuom seche 2 e ng’ich mar ot; 10:10, 11. 10 E giko, ne oloso sampuligo maber e PBS ka otiyo gi rangi ma ng’ato nyalo ng’iyogo kendo bang’e oketgi e wi slide mar maikroskop ka otiyo gi Aqua-Poly/Mount.
130 mg/kg) kod xylazine (10 mg/kg) kendo ne oketgi e bwo dende gi yath ma dwoko rem (5 mg/kg) . Oketo ng’ut ng’ato oko kendo otiyo gi masin mar ng’ado lak mondo otur ng’et ng’ut ng’ato ma luwore gi chogo ma mis (kowuok e lambda: yiwe 1.8, 1 ma ni e bath ng’ut ng’ato, ma luwore gi chogo ma ng’ato nigo IV kod V). Ti kod sirinji ma otur mondo ilos maber ng’injo matin e ng’ut ng’ato mondo kik oketh remo ma ni e piny. Kae to ng’injo matin ma oting’o ng’injono iketo mos e ng’injo matin (chakre -1.3 nyaka -1 e bath ng’injo ma iye), kendo 200 nyaka 300 nl AAV iketo e ng’injo matinno (Narishige) ka itiyo gi sirinji mag lwedo (Narishige) kuom kinde ma 100 nyaka 2000. dirisa mar dakika. Bang’ keto pi e del, iket kapilari kuom dakika 10 mamoko mondo owek virus olandre chuth. Bang’ ka osegol kapilari, ng’ado ng’ut ng’ato maber mondo ogeng’ ng’ich mar ng’ut ng’ato kendo omi leno oyud teko. Ne itiyogo gi yath ma dwoko rem (caspofen) kuom ndalo mang’eny bang’ ka osetimnegi opareson, kendo e kindeno ne itimo nonro matut kuom chal mar ringregi kae to ne inegogi e kinde ma ne oketnegi. Gik moko duto ma ne otimre ne otimre kaluwore gi chike mag piny Ulaya, mag pinyno, kod mag riwruoge kendo ne oyienegi gi ng’at ma ne ochung’ ne pinyno, ma ne ni e piny Jerman.
100 mg/kg) kod xylazine (10 mg/kg), kendo ne oketo PBS 0.1 M mokwongo e chunygi, kae to ne oketo 4% PFA e PBS. Ne ogolo ng’injono kendo oketo e 4% PFA/PBS kuom otieno achiel e 4°C. Ne otiyo gi ng’injo ma ng’injo (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) mondo oik ng’injo ma ng’injo (ma borne romo 50 μm) kowuok e obwongo ma ok ng’injo e PBS. Ka ok ondik yo machielo, ne itimo keto rangi e ng’injo ma ne nyalo ng’injo kaka ondik malo kanyo (13) e ng’injo mar ot kendo ka itiyo gi ng’injo. 100/PBS ma nigi 0.5% kuom dakika 15 e ng’ich mar ot; 10:10, 11. 10 ng’ato nyalo ng’ado bura kuom ng’ado bura kuom dakika 25 kar timo kamano. Bang’e, ne oketi ng’injogo gi gik ma geng’o tuoche (neno Tebol S1) e ng’injo ma geng’o ng’injo (3% BSA/PBS) e 4°C ei otieno duto ka ng’injono ng’injo. Odiechieng’ maluwo, ne oloso ng’injogo gi buffer ma geng’o tuoche kendo ne oketogi e ng’injo ma nyalo geng’o tuoche ma nyalo geng’o tuochego kuom seche 2 e ng’injo mar ot; bang’e, ne oloso ng’injogo maber e PBS, kendo ne oketo rangi ma DAPI, kae to ne oketogi gi AquaPolymount.
Ne otiyo gi gino ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik madongo ma ng’ato nyalo neno gi wang’e (TCS SP8-X kata TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ma nigi laser mar ler marachar kod laser mar 405 diode ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik moko mondo okaw picha mar gik ma ne oneno. Ka ng’ato otiyo gi program mar LAS-X mar choko piche ma oting’o piche ma luwore gi kaka Nyquist notimo gik moko e yo ma luwore: kuom paneli ma ok gin mag kwan, en ranyisi ma nigi teko ahinya (kaka ranyisi, e sel mag ringruok kod namba mag Hybrid) mt Mod mar R maler). Gitiyo gi ns kowuok e 0.3 nyaka 6 mondo giduok piny gik ma timore bang’e.
Picha mag seche ma adier mag sel ma opogore opogore. Bang’ ng’ado e kind gik ma nigi 1% mar B27 kod 0.5 mM mar GlutaMax, ne iketo sel mapiyo e wi gik ma ne oting’o gilasi ma nigi poly-l-lysine. mondo ochung’ motegno. Ne otim picha e kinde ma adier e masin ma ng’iyo gik matin ma ng’ato nyalo neno gi wang’e ma nigi laser marachar, ma iluongo ni HyD, ma nigi lens ma nigi mo ma romo 63×[1.4 namba (NA)) kod stej mar ng’iyo gik moko ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik moko.
Ne oket ng’atno e ng’ut ng’ato mapiyo kendo ne ogol wiye, ne ogolo obwongo mapiyo e wi ng’ut ng’ato, kendo ne ogoye e ng’ut ng’ato ma nigi bor mar 200 μm (mar timo tem mar keto nying’ mar 13C) kata 275 μm (mar timo tem mar foton ariyo) ma ne opong’ gi gik ma luwogi. 125 mM ma ng’ich kaka baraf, ma opong’ gi carbon (95% O2 kod 5% CO2) ma nigi Ca2 matin + pi ma ng’ato nyalo ng’ado e obwongo (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM buffer m2, pho5. glukos, 0.5 mM CaCl2 kod 3.5 mM MgCl2 (presa mar 310 nyaka 330 mmol). 125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 25.0 mM d-glucose pH 7.4 kod 310 nyaka 320).
E kinde ma ne itiyogo e ng’ado picha, ne itero ng’injogo e ot ma ne ochung’ne ng’ado picha, kendo ne itimo nonrono e bwo ng’injo ma ne dhi nyime gi ACSF e ng’injo ma ok lokre ma romo 32° nyaka 33°C. Ne otiyo gi gino ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik ma ng’ato nyalo neno gi wang’e ma nigi lens ma ng’ato nyalo ng’iyogo (NA 0.95, pi), laser mar Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) e ng’ado picha mag ng’ato. Modul mar FLIM (pikoharp300, pikokwant).
FLIM mar grx1-rogfp2. <2Zepa> 10:10, 11. 10 Ne opimre gi FLIM ma nigi foton ariyo e ng’injo mag obwongo ma ne ochung’ne ng’injo mag obwongo, kama gino ma ne ng’injogo ne ng’injogo. E rang’iny mar PN, ng’at ma yudo gik moko oyier ma romo 50 nyaka 80 μm piny mar ng’injo mondo gine ni nitie PN ma nyalo tiyo (manyiso ni, onge ng’injo ma nigi ng’injo kata lokruok ma nyalo timore e ng’injo ma ni e kor ng’injo) kendo ni nitie gik ma nyalo miyo ng’injo obed maber ariyo. mCheri). Chok piche ma nigi stek achiel ka itiyo gi zoom mar 2x [bor mar yamo mar gombo: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo: HyD ma iye, grup mar filta mar FITC] kod ng’ado picha e kind dakika 2 nyaka 3 itiyogo mondo ine ni foton moromo ochoki (foton 1000 duto) mondo oketgi e ng’injo. 10:10, 11. 10 10 mM H2O2 ma ng’ato nyalo ng’ado e ACSF ma ng’ato nyalo ng’ado ( mondo omed ng’ado oksijen, ma miyo ng’ato bedo gi ng’eyo matut kuom kinde ma ng’ato nyalo dakgo). dwoko piny, ma kelo dwoko piny mar kinde ma ng’ato nyalo dakgo) (Fweny S8, D nyaka G). Ti kod program mar FLIMfit 5.1.1 mondo ipim duoko ma yudore, loso ng’injo achiel mar ng’injo mar picha duto gi IRF ma opim (tich mar dwoko mar gige tich), kendo χ2 en mana 1. itiyogo e ng’ado kwan.
Ong’iyo nyalo mar mitokondria. 100 nM TMRM ma ne omedi e ACSF ma ne oting’o pi kuom dakika 30, ne ipimo lokruok ma ne nyalo timore e PNs ka itiyo gi masin ma nigi foton ariyo. TMRM ne otim picha kuom keto picha e 920 nm kendo tiyo kod HyD ma iye (585/40 nm) mondo ochok ranyisi; 525/50) mar ng’ado mtYFP. Ti kod program mar ImageJ mar kwano picha mondo ipim nyalo mar mitokondria e rang’iny mar sel achiel. E yo machuok, kwan mar plug-in: ranyisi = dakika (mtYFP, TMRM) itiyogo mar ng’eyo kama mitokondria nitie ma nyiso ranyisi mar TMRM e dho Somalia e picha mar konfokal ma nigi stek achiel mar chanel ma luwore. Kae to pixel ma ni e mask ma owuokgo ipimo, kae to iketo kaka pile e wi picha ma luwore gi ng’injo achiel mar mtYFP mondo oyud ng’injo mar mitokondria ma nyiso nyalo mar mitokondria.
Ne oket pichano oko ka itiyo gi program mar Huygens Pro (ma ng’ato nyalo ng’ado picha mag sayans). Kuom piche ma oseskan mag tael, loso tael achiel itimo ka itiyo gi yor loso ma otomatik ma program mar LAS-X chiwo. Bang' rango picha, ti kod ImageJ kod Adobe Photoshop mondo imedo loso picha kendo ilok ler gi pogruok e yoo maromre. Ti kod masin mar loso piche mag Adobe mondo ilos piche.
mtDNA keto pach kuom ng’iyo. Ne opim kwan mar ng’injo mag mtDNA e ng’injo mag obwongo ma ne ondikie gik ma geng’o DNA ka itiyo gi gino ma neno gik matindo ma ng’ato neno gi wang’e. Ne oloso kama ng’ato ka ng’ato ma ne ochung’ne ringre sel kod nuklia mar sel ka sel, kendo ne okwano kama ne ochung’ne ka otiyo gi program mar ImageJ. Oting’o kar nuklia kuom kar ringruok mar sel mondo iyud kar satoplasma. Kae to, ne otiyo gi program mar ng’iyo gik moko (software mar ImageJ) mondo opim gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo ma nyiso ni mtDNA ni e picha ma ng’ato nyalo ng’iyogo, kendo duoko ma ne oyudre ne oket kaka PN ma ne oting’o CTRL. Gik ma yudore inyiso kaka kwan mar nukleoside ma ni e sel ka sel.
Nonro mar kaka protin nyisore. Ti kod program mar ImageJ mar kwano picha mondo ipim kaka protin nyisore e PN e rang’iny mar sel achiel. E yo machiek, e picha mar ng’ato achiel ma ng’ato nyalo ng’iyogo, kokalo kuom kwan ma wacho ni: ranyisi = min (mtYFP, gik ma geng’o tuoche), ng’ato nyalo ng’eyo kama ng’ato nyalo ng’adoe bura kuom gimoro ma geng’o tuoche ma ni e Purkina. Kae to pixel ma ni e mask ma owuokgo ipimo, kae to ikete kaka pile e wi picha ma luwore gi ng’injo achiel mar mtYFP mondo oyud ng’injo mar protin ma inyiso.
Nonro mar kwan mar sel mag Purkinje. Ne otiyo gi plug-in mar ImageJ mar kwano kwan mar sel mag Purkinje kuom pogo kwan mar sel mag Purkinje ma okwan gi bor mar ring’o mar ng’ut ma sel ma okwanno oting’o.
Iloso kendo choko sampuli. Ong’ut ma ne owuok e grup ma ne ochung’ne ng’ato kod oyieyo ma ne nigi Mfn2cKO ne oketi e 2% PFA / 2.5% glutaraldehyde e 0.1 M buffer mar phosphate (PB), kae to ne oloso ng’injo mag korona ka oti kod ng’injo mar ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria). 1.5% mar potasium ma ng’ato nyalo ng’ado e ot kuom seche 1. Ne oloso ng’injogo nyadidek gi pi ma ne oting’o ng’injo, kae to ne oketo 70% mar ethanol ma nigi 1% mar uranyl asetat kuom dakika 20. 14040) e kind slide mag glas ma ne oting’o silikon, kendo bang’e ne giketogi e 60°C e oven. Ne oyier kama ng’ato nyalo ng’adoe ng’ut ng’ato kendo ne ogolo ng’injo matin ahinya ma borne romo 50 nm kendo ne oting’o ng’injo ma ng’injo ma nigi 2×1 mm ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne oting’o 2×1 mm. Ne oket rangi e ng’injogo gi ng’injo mar 4% mar uranyl asetate e pi kuom dakika 10, kae to olose gi pi mang’eny, bang’e olose gi pi mang’eny kuom dakika 10, kae to olose gi pi mang’eny. Mikrograf ne okaw gi masin ma ng’iyo gik matin ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik moko ma ng’ato nyalo ng’iyogo, ka otiyo gi kamera mar ng’iyo gik moko madongo ma iluongo ni TVIPS (Sistem mar loso vidio kod piche) ma iluongo ni TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Amerka). Jerman).
Ka ne itiyo gi mice ma ne nigi AAV, ne ipogo obwongo kendo ipogo e ng’et ng’ut ma nigi ng’injo ma romo milimita 1, kendo ne inono obwongo matin ka itiyo gi gino ma neno gik matindo ma nyalo neno gik matin mondo ong’e ring’o ma ne nigi AAV (ma en, mCherry ma nyiso). <2Zepa> En mana temo ma ng’ato ketoe AAV miyo ng’ato bedo gi nyalo maduong’ ahinya mar loko gik ma ng’ato nyalo ng’eyo e wi ng’injo mar Purkinje (ma en chiegni ng’injo duto) e ng’injo ariyo ma luwore mag ng’injo. 4% PFA kod 2.5% glutaraldehyde e 0.1 M mar koko) kendo ne otimnegi tich mathoth. 10:10, 11. 10 Kaka EPON oket, tishu ma ne ochung’ motegno ne oloso gi 0.1 M mar ng’injo mar ng’injo (Aplichem), kendo ne oketgi gi 2% mar OsO4 (os, Tije mag Sayans; <2Zepa> Inyalo timo kamano nyadi 3 ka itiyo gi bafa mar 0.1 M. Bang’e, ne itiyo gi ng’injo ma ng’ato nyalo ng’iewo mondo oket ng’injo ka ng’injo e 4°C kuom dakika 15 mondo ogol pi e del. Ne oter ng’injono e okside mar propylene kendo okete e EPON (Sigma-Aldrich) kuom otieno achiel ma ne nigi 4°C. Ket tishu e EPON ma ng’ich e ng’ich mar ot kuom seche 2, kae to ikete e ng’ich mar 62°C kuom seche 72. Ti kod gino ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik matin ahinya (Leica Microsystems, UC6) kod pala mar diamond (Diatome, Biel, Switzerland) mondo ing’ad ng’injo ma ng’injo ahinya ma romo 70 nm, kendo iket rangi gi 1.5% mar uranyl acetate kuom dakika 15 e 37°C, kendo iket rangi gi lead citrate mar dakika 4. Ne okaw gik ma ne itiyogo e ng’iyo gik moko ma ne itiyogo gi masin ma ne itiyogo gi gik ma ne itiyogo e ng’iyo gik moko ma ne itiyogo (JEOL) ma ne nigi program mar ng’iyo gik ma ne itiyogo e ng’iyo gik moko. Mondo otim nonro, ne okawo piche matindo mag elektron ma nigi zoom ma romo 5000× kata 10,000×.
Ong’iyo kaka mitokondria chalo. Kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik moko duto, ne ondiki gi lwedo e piche mag dijital ka otiyo gi program mar ImageJ. Ginono gik mopogore opogore mag morfoloji. Density mar mitokondria inyiso kaka pasent ma yudore kuom pogo kwan mar mitokondria duto mar sel ka sel gi kwan mar sitoplasma (kwan mar sel = kwan mar sel-kwan mar nuklia mar sel) × 100. Kido mar mitokondria ikwan ka itiyo gi fomula mar [4π∙2(kwan)/perimita. Ne otim nonro kuom kaka ista mag mitokondria chalo kendo ne opogogi e migepe ariyo (“ma nigi ng’injo” kod “ma nigi ng’injo”) kaluwore gi kaka ne gin madongo.
Namba mar otofagosome/laisosome kod ng’iyo pek mar gik moko. Ti kod program mar ImageJ mondo iket ranyisi mar ng’ato ka ng’ato ma ni e picha mar dijital. 100:10, 11. 10 Kabedo mar ng’ato ka ng’ato kuom ng’ato ka ng’ato kuom pogo ng’ato ka ng’ato kuom ng’ato ka ng’ato gi ng’ato ka ng’ato kuom ng’ato ka ng’ato gi ng’ato ka ng’ato (ng’ato ka ng’ato kuom ng’ato ka ng’ato) × 100. Density mar ng’ato ka ng’ato ma ng’ato nyalo ng’adoe bura, kwanre kuom pogo kwan duto gi kwan mar ng’ato ka ng’ato ma ng’ato nyalo ng’adoe bura (kaluwore gi ng’ato ka ng’ato) (ng’ato ka ng’ato nyalo ng’ado bura = ng’ato nyalo ng’ado bura-ng’ato).
Keto lebel mar ng’ado migepe madongo kod loso sampol. 125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaCl, 1.25 mM NaCl, 1.25 mM CO2. 25.0 mM d-glukos, 1.0 mM CaCl 2 kod 2.0 mM MgCl 2, ma oloki nyaka pH 7.4 kod 310 nyaka 320 mOsm), ma glukos en 13 C 6- Glukosis ma dwoko (Eurisotop, namba mar katalog CLM9-1). 125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 25.0 mM d-glucose. 1082, ng’ado pH 7.4 kendo 310 nyaka 320mOsm), kendo imed 1mM 1-13C. Iketo ng’injogo kuom dakika 90 e 37°C. E giko mar temo, ne oloso ng’injogo mapiyo ka otiyo gi pi ma nigi pi (pH 7.4) ma nigi 75 mM mar ammonium carbonate, kae to ne oketgi e 40:40:20 (v:v:v) mar pi. Bang’ ka oseket ng’injogo e wi baraf kuom dakika 30, ne oketo gik ma ne okawo e ng’injo mar 21,000 g kuom dakika 10 e 4°C, kendo ne oketo gik ma ne odong’ e wi baraf maler e masin mar ng’injo mar SpeedVac. Ne oketgi e -80°C nyaka ne otimnegi nonro.
Rang'o mar pi mang'eny mar amino asidi 13 mondiki C. Kaka ng’ato nyalo ng’eyo ni ng’ato nyalo ng’iyo gik ma ng’ato timo, ne oketo ng’injo ma ng’ato nyalo ng’iyogo kendo e 75μl mar pi ma nigi rang’iny mar LC-MS (Honeywell). Bang’ ng’ado 21,000 g kuom dakika 5 e 4°C, 20 μl mar pi ma ne oler ne otigodo e ng’iyo ng’injo mar amino asid, to ng’injo ma ne odong’ ne otigodo mapiyo piyo e ng’iyo ng’injo mar anion (ne piny kae). Ne otim nonro mar amino asid ka oti kod yo ma ne oler motelo mar ng’ado bura (55, 56). 10μl mar 100 mM mar sodium carbonate (Sigma-Aldrich) ne omedi e 20 μl mar ng’injo mar ng’injo, kae to 10 μl mar 2% mar ng’injo mar ng’injo (Sigma-Aldrich) ne omedi e ACN ma nigi rang’iny mar LC. Ne oket sampolno e vortex kuom thuolo matin kendo bang’e ne oketgi e g 21,000 kuom dakika 5 e 20°C. Oting’o pi ma oseyueyo e wi ng’injo ma nigi 2 ml ma nigi gik ma iketo e glas ma nigi ng’injo (200 μl). Ne otim nonro kuom gik ma ne otimre ka otiyo gi sistem mar LC (Waters) ma nigi nyalo maduong’ ahinya mar Acquity iClass ma ne oriw gi sistem mar LC (QE)-HF (Ultra Field Orbitrap) ma nigi nyalo maduong’ ahinya mar ng’iyo gik moko e yo makare (Thermo Fisher Scientific). 100 × 1.0 mm mar silika T3 ma nigi teko maduong’ (Pi) ma ne nigi gik ma romo 1.8 μm. 100 μl/min, kendo sistem mar ng’ado pi nigi ng’ado A (10 mM mar ng’ado pi kod 0.15% mar asid mar formik e pi) kod ng’ado pi B (ACN). <2Zepa> 0%B e dakika 0; 0% B. 0 nyaka 15% B e dakika 0 nyaka 0.1; 15 nyaka 17% B e dakika 0.1 nyaka 0.5; B e 17 nyaka 55% e dakika 0.5 nyaka 14; B e 55 nyaka 70% e dakika 14 nyaka 14.5; 14.5 nyaka 70 nyaka 100% B e dakika 18; 100% B e dakika 18 nyaka 19; 100 nyaka 0% B e dakika 19 nyaka 19.1; 0% B e dakika 19.1 nyaka 28 (55, 56). 106, kendo ng’injo ma itiyogo en 60,000, kendo ng’injo ma itiyogo en 3×106, kendo kinde maduong’ mar ion ma ng’ato nyalo yudo en 3×106. Oboke ma ng’ato nyalo ng’adogo ng’ato (ESI) tiyo ka ng’ato ng’ado yamo ma romo 3.5 kV, ng’ato nyalo ng’ado yamo ma romo 250°C, yamo ma romo 60 AU (yunit ma ok owinjore), kod yamo ma romo 20 AU. 250°C. Lens mar S oket ni 60 AU.
Kromatografi mar anion-MS nonro mar asidi ma nigi nying' mar 13C. 10:10, 11. 10 Ne otim nonro kuom gik ma ne odong’ ma ne odong’ (55μl) ka oti kod sistem mar ng’iyo gik ma ne odong’ e ion (ICS 5000+, ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik moko) ma ne oriw gi gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik moko ma ne odong’ (QE-HF). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, 5 μl mar gik ma oting’o ng’injo ne oketi e ng’injo mar Dionex IonPac AS11-HC ma ne oting’o HPLC (2 mm × 250 mm, ng’injo mar ng’injo 4 μm, Thermo Fisher Scientific) e yo ma ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar 1. 4μm, Josayans mag Jalupo ma nigi liet). Giketo ng’ich mar ng’ich e 30°C, kendo ng’ich mar ng’ich mar ng’ich iketo e 6°C. Ti kod katrij mar potasium haidroksaid ma ochiw gi pi ma onge ion mondo okel potasium haidroksaid ma ng’injo kokalo kuom jenereta mar eluent. 380μl/dakika, ka itiyo gi ranyisi maluwogi: dakika 0 nyaka 3, KOH 10 mM; 3 nyaka 12, KOH 10 nyaka 50 mM; 12 nyaka 19, KOH ma romo 50 nyaka 100; 19 nyaka 21 dakika , 100 mM KOH; 21 nyaka 21.5 dakika, 100 nyaka 10 mM KOH. mM KOH kuom dakika 8.5.
150μl/min mar isopropanol ma medo ng’injo bang’ ng’injono, kae to iorogi e ranyisi ma nigi ng’injo ma malo ma tiyo e yor ionization ma okber. MS ng’iyo ng’injo mar m/z 50 nyaka 750 ka nigi ng’injo mar 60,000. AGC oket ni 1×106, kendo kinde ma ion ma malo moloyo oket ni en 100 ms. <2Zepa> ESI ma ne oting’o liet ne tiyo gi teko mar 3.5 kV. Gik mamoko ma iketo e ion gin kaka luwogi: ng’ich mar kapilari 275°C; ng’injo mar gas ma ng’injo, 60 AU; AU e 300°C, kendo lens mar S ma iketo nyaka 60 AU.
13C ma ondiki ni gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo. Ti kod program mar TraceFinder (weche mag 4.2, Sayans mar Thermo Fisher) mar nono weche mag kwan mar isotop. Ne ochung’ne ng’eyo mar ng’ato ka ng’ato kuom ng’ato ka ng’ato ma ne nyalo geno kendo ne otimne nonro kuom ng’ato ka ng’ato. 13C (Mn) ne owuok e [M + H] +, kama n en namba mar karbon mar gik ma ochung’ne, ma itiyogo e ng’iyo asidi mag amino kata [ MH] + itiyogo e ng’iyo anion. Gima ng’ato nyalo timo en XIC matin moloyo ng’injo abich kuom milion achiel, to ng’injo mar RT en dakika 0.05. Otim nonro mar ng’ado bura kuom kwano kwan mar isotop ka isotop ma oyudre gi kwan mar isotop duto mag gik ma luwore. Ratio ma kamago imiyo kaka kwan mar pasent mar isotope ka isotope, kendo duoko ma yudore inyiso kaka kwan mar pasent mar molar (MPE), kaka ne oler motelo (42).
Ne oket ng’injo ma ne oting’o ng’injo ma ne opong’ gi ng’injo ma ng’injo kaka baraf, ne oketo ng’injo ma ne opong’ gi ng’injo, kendo ne oketo e ng’injo mar -20°C kuom dakika 30. Oting’o sampol kendo kendo oting’o +4°C kuom dakika 30. 21,000 g kuom dakika 5 e 4°C, kae to ne ochoki gik ma ne owuok e iye kendo otwegi ka oti kod gino ma ne oting’o pi ma ne ochung’ne SpeedVac e 25°C mondo otimnegi nonro bang’e. Kaka ne olere malo kanyo, ne otim nonro mar LC-MS kuom asidi mag amino mag sel ma ne oket mopogore opogore. Ka itiyo gi gino ma ng’ato nyalo ng’eyogo gik ma ng’ato nyalo ng’eyo (version 4.2, thermo Fisher Scientific), ne otim nonro mar weche ma ne ondiki ka otiyo gi gik ma ng’ato ka ng’ato nyalo ng’eyo. 10:10, 11. 10 Ne otim nonro mar kwan mar gik ma ne otimre e ringruok ka oti kod program mar program mar loso gik moko (57).
Iloso mar ng’injo. Ne oket ng’injo mapiyo piyo ka otiyo gi yamo ma kelo ng’injo kendo ne ogol wiye, ne ogolo obwongo mapiyo e wi ng’injono, kendo ne otiyo gi pala ma ne opong’ gi baraf ma ne ng’injo (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) mondo otur ng’injono obed gi ng’injo ma romo 300 nyaka 375 μm. 125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosfete baffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukose, 1.0 mM CaCl2 kod 6.0 mM Mg302. msm). 125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM Ca5C. kendo 310 nyaka 320). Ket slicego kuom dakika 20 nyaka 30 mondo ibed gi nyalo mar dwokogi kapok irekod.
rekod. Ne otiyo gi stej mar maikroskop ma ne nigi kama ok ng’iyore mar mako gik moko kod lens ma nyalo ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik moko duto ma ne oting’o pi (Scientifica). Ne ong’ere ni sel mag Purkinje ma ne ipare ni ne gin (i) duong’ mar ringruok, (ii) kama ng’ut ng’ato nitie, kod (iii) kaka ng’ut ng’ato ne ng’iyo gik ma ng’ato nyalo ng’eyo. 150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) kod pipet ma nigi ng’injo ma ng’injo ma ng’injono ng’injogo. Gik moko duto ma ne ondiki ne otim gi masin ma ne itiyogo gi program mar Signal (ma en program mar Signal) ma ne itiyogo. Ne otim nonrono e kwan mar 12.5 kHz. Signalno itiyo gi filta ariyo mag Bessel ma ng’ato nyalo ng’ado e yo machuok kendo ma nigi frekwensi ma ng’ato nyalo ng’ado ma romo 1.3 kod 10 kHz. Kapasitansi mar membrane kod pipet dwoko gi sakiut mar dwoko ma tiyo gi gino ma medo dwol. Gik moko duto ma ne otimre ne otim e bwo loch mar kamera ma iluongo ni Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), ma ne ochung’ne program mar Hokawo (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Keto kod nono sel duto kaka pile. Kapok ondiki rekod, pong’ pipet gi pi ma iye ma nigi gik maluwogi: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM Guphano. (Na) kod 10.0 mM mar kreatinin fosfet ne oloki nyaka pH mar 7.25, kendo ng’wech mar pi ne en 290 mOsm (sukros). Bang’ tiyo kod teko mar 0 pA mondo otur ng’injo, ne ipimo nyalo mar ng’injo ma ne oling’. <2Zepa> 10:10, 11. 10 Gipimo ng’wech mar ng’ado bura kuom tiyo gi stima ma ng’ato nyalo ng’ado e wi ng’ato ma nigi -40, -30, -20, kod -10 pA. Pim pek mar dwoko mar voltej kendo iti gi chik mar Ohm mar kwano pek mar gik ma donjo. 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, Amerka) ne ondiki gik ma ne timore giwegi e klamp mar ler kuom dakika 5, kendo sPSC ne ong’ere kendo opim e Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, Amerka) ka otiyo gi skrip ma ng’ato nyalo ng’eyogo gik moko owuon. IV ng’injo kod ng’injo ma ok ng’injo ipimo kuom keto betri e nyalo mopogore opogore (chakore gi -110 mV) kendo medo ng’injo e okang’ mar 5 mV. Ne otemo loso AP kuom tiyo gi stima ma ketho ler. <2Zepa> Keto selno e -70 mV ka itiyo gi mtoka ma kelo ng’ol. Loki step mar ng’ato ka ng’ato ma keto rekod mopogore opogore (10 nyaka 60 pA). Kwan frekwensi mar AP ma malo moloyo kuom kwano gi lwedo ng’injo mag pulse ma kelo frekwensi mar AP ma malo moloyo. AP ng’ado ng’wech kuom tiyo kod ng’at mar ariyo ma wuok kuom pulse mar depolarization ma okwongo kelo AP achiel kata mathoth.
Konfigurasion kod nono mar patch ma opong' gi buche. Tim rekod mar patch ma opong' gi hoho ka itiyo gi chike ma kawaida. 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM hepes, 0.1 mM EGTA kod 2 mM MgCl2, kendo ilok pH 7.2 (ka itiyo gi KOH). ATP kod GTP ok oketi e ng’injo ma ni e iye mondo ogeng’ ng’injo ma ok ochung’ne ng’injo mar selo. Pipet mar ng’injo opong’ gi ng’injo ma nigi amphotericin (ma romo 200 nyaka 250 μg/ml; Amphotericin ne oketgi e dimethyl sulfoxide (ng’injo mogik: 0.1 nyaka 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). DMSO ma ne otigodo ne onge gi teko maduong’ ma ne otimo kuom ng’injo ma ne otimne nonro. E kinde ma ne itimoe tich mar ng’ado ng’wech, ne idhi nyime gi ng’iyo ng’wech mar ng’wech (Ra), kendo ne ochako timo temo bang’ ka ng’wech mar Ra kod AP osebedo motegno (dakika 20-40). Gik ma timore giwegi ipimo e klamp mar voltej kod/kata mar stima kuom dakika 2 nyaka 5. Ne otim nonro mar weche ma ne ondiki ka otiyo gi Igor Pro (weche mag 2010, ng’iyo mar Microsoft, Redmond, Amerka) kod GraphPad Prism (weche mar 8.1.2. Amerka). Mondo ng’ato ong’e AP ma timore giwegi, itiyo gi program mar IgorPro ma ng’ato nyalo ng’adoe bura. Ong’eyo APs owuon ka otiyo gi rang’iny ma ochiw, ma iloko achiel ka achiel kuom rekod ka rekod. Ka itiyo gi thuolo mar spike, ng’e frekwensi mar spike gi frekwensi maduong’ mar spike mapiyo kod frekwensi mar spike ma diere.
PN bedo kende. Ka ng’ato ng’ado bura kaluwore gi chenro ma ne ogol chon, PNs ne olosi ka owuok e ng’ut ng’ato e ng’ut ng’ato e kinde ma ne oket (58). Kaka ng’ato nyalo ng’eyo, ne ogolo ng’ut ng’ato kendo otur e gik ma ng’ich kaka baraf [ma onge HBSS Ca2+ kod Mg2+, ma ne omed gi glukosis ma romo 20 mM, penisilin (50 U/ml) kod streptomycin (0.05 mg/ml)], kae to oting’o ng’ut ng’ato gi ng’ich ma ng’ich kaka baraf. U / ml) kod deoksiribonuklease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Ti kodgi kuom dakika 30 e 30°C. Mokwongo, lwok tishu e HBSS ma nigi ng’injo mar tong’ (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) kod DNase (0.1 mg/ml) e liet mar ot mondo ogeng’ ng’injo mar enzyme, kae to e HBSS ma nigi glukosis 20 mM. (0.05 mg/ml) kod DNase (0.1 mg/ml) golo sel achiel achiel. 1110 rpm, dakika 5, 4°C) kendo ne oketgi kendo e kar ng’ado sel [HBSS, ma opong’ gi glukosis mar 20 mM, 20% mar ng’injo mar nyathi ma pod ni e ich). (0.05 mg/ml)]; ng’iyo kaka sel nyalo dak ka itiyo gi ng’injo mar ng’injo kendo loko kwan mar sel mondo obed 106 nyaka 2×106/ml. Kapok otim nonro mar ng’injo mar ng’injo, ne itiyo gi ng’injo ma ne itiyogo e ng’injo mar 50 μm.
Saitomita mar pi. Ne otim ng’ado ng’injo mar sel e 4°C ka otiyo gi masin mar FACSAria III (BD Sayans mar Gik Modak) kod program mar FACSDiva (BD Sayans mar Gik Modak, versi 8.0.1). 100 μm e bwo ng’wech mar 20 psi e ng’wech mar ~2800 gik matimore/sekon. Kaka yore machon mag ng’ado dhoot (duong’ mar sel, ng’ado bura mar yore ariyo, kod kido mag lando) ok nyal neno ni PN opogore maber gi kit sel mamoko, yo mar ng’ado dhoot iketo kaluwore gi pimo ma achiel ka achiel mar ng’wech mar YFP kod ng’wech mar mitoYFP + kod mitoYFP ma rito. YFP kelo mor kuom keto ler e sampulino gi laini mar 488 nm, kendo ranyisino fwenyre ka itiyo gi filta ma ng’ado ler mar 530/30 nm. E winyo ma nigi ng’injo, teko ma ng’ato nigo mar ng’injo mar Rosa26 bende itiyogo mar pogo ringruok mar ng’injo kod ng’injo mag ng’injo. 7-AAD iloso gi laser ma ratong’ ma romo 561 nm kendo ifwenyo gi filta ma romo 675/20 mondo ogol oko sel ma osetho. Mondo opog ng’injo mag kor lwasi e kinde achiel, ne oketo ACSA-2-APC e ng’injo mar ng’injo mag kor lwasi, bang’e ne otiyo gi filta ma ng’injo mar 640 nm mondo ong’e ranyisino.
1110 rpm, dakika 5, 4°C) kendo ne okete e -80°C nyaka chop otigodo. Mfn2cKO mice kod nyithindgi ma nigi ng’injo iketo e odiechieng’ achiel mondo ogeng’ ng’injo mag yore mag timo gik moko. Ne otim nonro mar FACS ka otiyo gi program mar FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Amerka).
Kaka ne owach malo kanyo (59), PCR ma tiyo e kinde adier itiyogo mar pogo DNA kuom ng’injo ma osepogore mondo otim nonro mar mtDNA bang’e. Ne otim temo mokwongo mar ng’eyo kaka ng’ato nyalo ng’iyo gik moko ka otiyo gi qPCR kuom namba mopogore opogore mag sel. 300 PN e buffer mar lysis ma nigi 50 mM tris-HCl (pH 8.5), EDTA 1 mM, Tween 20 ma romo 0.5% kod proteinase K (200 ng/ml) kendo iketgi e 55°C kuom dakika 120. Ne oket selgo e 95°C kuom dakika 10 mondo gine ni proteinase K ok otiyo chuth. Sayans, namba mar katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Sayans mar ng’ato, namba mar katalog AIVI3E8) kod 18S (Sayans mar ng’ato, namba mar katalog Hs99999901_s1) mag jin.
Tekruok mar sampol mar proteom. Ka ng’ato oting’o ng’injono e 95°C kuom dakika 10 kendo otimo ng’injo, e buffer mar ng’injo [6 M kloraid, 10 mM tris (2-karboksietil), 10 mM kloroasetamid kod 100 mM tris-HC pellet e ng’injo ma ng’ich]. (Sekon 30 mag ng’ato / sekon 30 mag weyo). 1:10 e 20 mM tris-HCl (pH 8.0), oriw gi 300 ng mag trypsin dhahabu (Promega), kendo okete e odiechieng’ achiel e 37°C mondo oyud ng’injo chuth. E odiechieng’ mar ariyo, ne oketo ng’injo e g 20,000 kuom dakika 20. Ne oting’o pi ma ne oting’o pi ma ne opong’ gi asid mar formik ma 0.1%, kendo ne oting’o pi ma ne oting’o pi ma ne oting’o pi ma ne oting’o pi ma ne oting’o StageTips ma ne olosi giwegi. Ne oket sampolno e gino ma ne itiyogo gi SpeedVac (gimo ma ne itiyogo gi 5305) e 45°C, kae to ne oketo peptide e asid ma ne nigi 0.1%. Sampol duto ne olosi e kinde achiel gi ng’at achiel. Mondo otim nonro kuom gik ma ng’ato oting’o e kor lwasi, ne oketi 4 μg mar gik ma ng’ato nyalo ng’ado e kor lwasi (TMT10plex, namba mar katalog 90110) ma nigi kwan mar gik ma ng’ato nyalo ng’ado e kor lwasi ma romo 1:20. Kaka ng’ato nyalo keto ranyisi mar TMT, 0.8 mg mar gik ma itiyogo ne oket kendo e 70 μl mar ACN ma onge pi, kendo peptide ma ne otho ne oket kendo e 9 μl mar TEAB 0.1 M (bikarbonat mar triethylammonium), ma ne omedi 7 μl mar gik ma itiyogo e ACN. Oganda ma ne oting’o wechego ne gin 43.75%. Bang’ dakika 60 mag ng’ado ng’ato, ne okethore gi 2 μl mar 5% mar ng’ado ng’ato. 200 μl mar asid mar formik (FA) ma 0.1%, ne opogogi ariyo, kae to ne ogolgi ka gitiyo gi StageTips ma ne giloso giwegi. Ka itiyo gi gino ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo, achiel kuom nus ariyogo ne opong’ gi gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo ma nigi 1mm x 150mm. Jalony mar Sayans mar Rech). 1% nyaka 50% mar ng’injo B kuom dakika 85 ka ng’injo mar dakika 96, ng’injo mar 50% nyaka 95% kuom dakika 3, bang’e dakika 8 kuom 95 % mar ng’injo B; Bafa A en 5% ACN kod 10 mM ABC, to bafa B en 80% ACN kod 10 mM ABC. Chok ng’injo bang’ dakika 3 ka dakika kendo iketgi e grup ariyo (1 + 17, 2 + 18, kod mamoko) kendo iketgi e masin ma ng’injo ma ok ng’injo.
LC-MS/MS ng’iyo. 119.aq) ne opogore e wi ng’injo mar picoFrit ma borne romo 25 cm, 75 μm (lens manyien mar gik ma ng’ato neno, namba mar ng’injo PF7508250) ma nigi 1.9 μm ReproSil-Pur CD (12). 1200 (Sayans mar jolupo mag liet, Jerman). Ne oketo kolomno e 50°C. Bufa A kod B gin 0.1% mar asidi mar formik e pi kod 0.1% mar asid mar formik e 80% mar ACN, kaka giluwore. Ne opogore gi 6% nyaka 31% mar ng’injo B kuom dakika 65 kendo kuom 31% nyaka 50% mar ng’injo B kuom dakika 5 ka ng’injo mar 200 nl/dakika. Ne otim nonro kuom peptides ma ne ogol oko e masin ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik ma ng’ato nyalo ng’iyogo. 120,000 e kind 350 nyaka 1500 m/z. 27% mar teko mar ng’anjo ma ng’ato nyalo ng’ado, ng’at ma nigi teko moloyo ma nigi ng’anjo mar 2 nyaka 6 oyier mondo otim ng’anjo ma nigi teko maduong’ mar C (HCD). <2Zepa> Kinde mar siklo oket ni 1 s. 104 m / z mar ng’injo mar peptide ne opim e ng’injo mar ion ka otiyo gi AGC matin moloyo ma 5 × 104 kod kinde maduong’ie moloyo mar keto ng’injo ma romo 86 ms. Bang’ ng’ado bura, ne oketo ng’at ma ne ochung’ motelo e list mar jogo ma ne ok oketgi e kindgi kuom s 45. 164942), kendo spektra mag wuotho ​​ne opim e wi spektromita mar ng’iyo pek mar Orbitrap Lumos (FAIMS) gige tich (Thermo Fisher Sayans) tiyo e voltej ariyo mag chudo mag −50 kod −70 V. MS3 ma oyier kaluwore gi gik ma kelo tudruok e kindgi itiyogo e pim mar signal mar ion mar ripot mar TMT. 1200, ka itiyo gi 90% mar ng’injo mar ng’injo, ma nigi ng’injo mar 6% nyaka 31%; FA ne en 0.1%, to B ne en 0.1% FA kod 80% ACN. Kolon mar ng’iyo gik moko tiyo e 50°C. Ti kod sitael ma onge chudo (versi 1.6, thermo fisher sayans) mondo ipog fail mokwongo kaluwore gi voltej mar chudo mar FAIMS.
Fwenyo kod kwan mar protin. Ka itiyo gi masin mar manyo weche ma iluongo ni Andromeda, ne otim nonro kuom weche ma ne ondiki chon ka itiyo gi mbui ma iluongo ni MaxQuant ma nigi 1.5.2.8. Kaachiel gi ranyisi mag Cre recombinase kod YFP ma ne oyudre kuom Aequorea victoria, ne otim nonro mar ranyisi mag ng’injo mag peptide mondo oyud ranyisi mag kanonik kod ranyisi mag isoform mag ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo (ID mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo mar ng’injo) Oksidason mar metionin kod asetilason mar protin N-giko ne oketi kaka lokruok manyalo lokore; ne oket kaka lokruok ma ok lokre. Gik ma itiyogo e ng’ado chiemo iketo e “ng’eyo makende” kod “tripsin/P.” Namba matin mogik mar gik ma itiyogo e ng’eyo protin en 1; namba matin mogik mar peptide makende en 0. E bwo chal mar map mar peptide ma chalre, kwan mar ng’eyo protin ne en 0.01. Oboke mar “Peptide mar Ariyo” oket. Ti kod “tudore e kind ng’wech” mondo iter gik ma nyalo konyo e kind fainde mopogore opogore mag adier. Ti kod LFQ kwan matin mogik mar 1 mar kwan maonge lebel (LFQ) (60). LFQ ng’enyne ng’ato nyalo ng’ado bura kuom kwan ariyo ma owinjore e grup achiel mar genotype e kinde ka kinde, kendo ng’ato ka ng’ato ng’ado bura kuom kwan mar ng’ato ka ng’ato ma nigi lach mar. 0.3 kendo dhi piny 1.8. Ti kod yo ma itiyogo gi kompyuta ma iluongo ni Perseus () kod R () mondo ipim duoko mag LFQ. 10:10, 11. 10 Ne otiyo gi tes mar t ma ng’ato nyalo ng’ado e yo ariyo ma wuok e program mar limma mondo otim nonro mar ng’ato ka ng’ato (61). Otim nonro mar weche ma ng’ato nyalo ng’eyo ka otiyo gi ggplot, ng’at ma ng’iewo gik moko, ng’at ma ng’iewo gik moko, ng’iewo gik moko. 1.6.10.43, 1.6.10.43. 2018. Nonrono oriwo gik ma nyalo konyo e loso ler mar isotope ma ne omiye gi ng’at ma noloso gik moko. Ti kod limma e R mar timo nonro mar nyiso pogruok. Data ma adier, duoko mag manyo data, kod tich mar nono data kod duoko duto okan e riwruok mar ProteomeXchange kokalo kuom kar keno mar jowete PRIDE ma nigi ranyisi mar data ma PXD019690.
Oboke ma tiyo miyo ng’iyo bedo maber. Ne otiyo gi gige ng’iyo yore mag ng’eyo (QIAGEN) mondo ong’e rieko mar weche mag ndiko ma tiyo mag data ma ne oket e juma 8 (Fweny 1). E yo machiek, list mar protin ma kwan ma yudore kuom ng’iyo weche mag LC-MS/MS (rang’iny mar kwan mar gik ma ng’ato nyalo ng’iyo) itiyogo gi yore maluwogi mag ng’ado gik moko: Mus musculus oyier kaka kit gik moko kod gik ma luwo bang’e, kendo kidienyno nyiso ni kwan mar P ma Benjamini noloko mondo oket 0.05 kata piny okawe kaka gima duong’. Kaka graf maeni, ng’injo abich madongo mag ng’injo e klas ka klas kaluwore gi kwan mar P ma oloki, onyis. Ka itiyo gi t-test mang’eny, ka itiyo gi chenro mar ng’ado ng’wech ma nigi step ariyo mag Benjamini, Krieger, kod Yekutieli (Q = 5%), ng’iyo mar ng’iyo gik ma ng’ato timo e kinde ma ng’ato nyalo ng’iyogo gik madongo ma ng’ato ka ng’ato nyalo ng’eyo e kidieny ka kidieny, kendo ng’ato ka ng’ato ng’iyo ng’ato ka ng’ato mopogore opogore. Onge dwaro mar rwako SD ma luwore.
Mondo wapim duoko mag nonro ni gi mbui ma osegoyo kendo loso picha mar Venn e ranyisi mar 1, ne waketo list mar protin ma kwan gi gik ma ondiki e MitoCarta 2.0 (24). Ti kod gige tich ma yudore e mbui ma iluongo ni Goro Picha mar Venn (ng’at ma ng’iyo gik ma ngima) mondo ilos pichano.
Ka idwaro ng’eyo matut kuom yore mag kwan ma itiyogo e ng’iyo gik ma nyalo ketho del, yie mondo ine achiel kuom sula ma luwore gi gik ma itiyogo kod yore mag timo nonro. Kuom temo mamoko duto, weche matut inyalo yudo e legend ma luwore gi wachno. Ka ok ondik yo machielo, weche duto inyiso kaka kwan mar ± SEM, kendo nonro duto mag kwan ne otim ka itiyo gi program mar GraphPad Prism 8.1.2.
Mondo iyud gik ma medore mag ndiko ni, yie mondo iyud gik ma medore e wi ndiko ni.
Mae en ndiko ma ji duto nyalo yudo ma ipogo e bwo chike mag Ratiro mar Oganda ma Oken mar Ohala, ma oyiene tiyogo, keto kendo loso e yo moro amora, mak mana ka tiyo kode mogik ok en mar yudo ber mar ohala kendo ma ng’ato nyalo ng’eyo ni tich ma ne ondik mokuongo en adier. Rango.
Par niya: Wakwayi mana ni imi adres mari mar e-mail mondo ng’at ma ioro e mbui ong’e ni idwaro ni one e-mailno kendo ni ok en e-mail ma ok owinjore. Ok wabi kawo adres moro amora mar e-mail.
Penjo ni itiyogo mar temo ka in jalendo kendo geng’o oro spam ma ok owinjore.
Oboke mag E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Larson
Ka ne otim nonro kuom ng’injo ma ok ti maber, ne ofwenyo ni program mag ng’injo mag ringruok itiyogo mondo ogeng’ ng’injo mag ng’injo.
Oboke mag E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Larson
Ka ne otim nonro kuom ng’injo ma ok ti maber, ne ofwenyo ni program mag ng’injo mag ringruok itiyogo mondo ogeng’ ng’injo mag ng’injo.
©2020 Riwruok mar Amerka mar Dongruok mar Sayans. ratiro duto oriti. AAAS en jahera mar Hinari, Agora, Oare, Chorus, Clocks, CrossRef kod counter. 2375-2548, Dhi nyime mar Sayans.